构建并验证OVX小鼠围绝经期模型
建立模拟围绝经期低雌激素状态的动物模型，并确认模型成功。
对8周龄C57BL/6J雌性小鼠行背侧单一切口双侧卵巢切除术（OVX），Sham组仅切开不切除。术后8周，通过阴道脱落细胞涂片HE染色观察动情周期，ELISA检测血清雌二醇水平，腹腔探查确认卵巢缺失。
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围绝经期小鼠5-HT能神经通路图谱及雌激素受体在5-HT神经传递中的作用阐明
Mapping the 5-HTergic neural pathways in perimenopausal mice and elucidating the role of oestrogen receptors in 5-HT neurotransmission.
实验完整度
高包含OVX动物模型构建与验证、全脑免疫组化图谱、CUT&Tag靶基因鉴定、双荧光素酶报告实验、立体定位注射激动剂/拮抗剂并监测体温等多层级验证。
主要模型
去卵巢（OVX）小鼠模型 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系
重点核对
小鼠品系：C57BL/6J，8周龄，体重17±1g OVX手术方式：背侧单一切口，1.25%三溴乙醇麻醉（0.02ml/g），结扎并切除卵巢 术后观察8周，通过阴道涂片HE染色和血清雌二醇水平确认模型成功 立体定位注射坐标：AP +4.7mm, ML 0mm, DV +4.0mm，注射体积2μl 药物剂量：ERα激动剂PPT 1mg/kg，ERα抑制剂AZD9496 1mg/kg，ERβ激动剂Liquiritigenin 7.5mg/kg，ERβ抑制剂PHTPP 1mg/kg
摘要
围绝经期综合征（PMS）包括潮热和抑郁等神经精神症状，这些症状与大脑中5-HT能神经通路的改变有关。然而，这些改变的具体变化和潜在机制仍不清楚。本研究使用去卵巢小鼠成功建立围绝经期模型，并通过免疫组织化学评估了这些去卵巢小鼠72个脑区中5-HT及其受体（5-HT1AR和5-HT2AR）表达的变化。尽管5-HT和5-HT1AR在整个大脑中广泛表达，但只有少数区域表达5-HT2AR。值得注意的是，与Sham组相比，去卵巢（OVX）组几乎所有脑区的5-HT表达均降低。在与潮热（视前区）或情绪障碍（杏仁核）相关的区域内，发现两种受体的表达改变。此外，在缝际核（RN）——一个已知调节体温的区域——的细胞中检测到雌激素受体（ER）α/β表达降低。结果表明，ERα/β正向调节参与5-HT代谢的酶TPH2/MAOA的转录活性。本研究揭示了围绝经期小鼠5-HT神经通路（5-HT、5-HT1AR和5-HT2AR）的变化，主要在与体温、情绪、睡眠和记忆调节相关的脑区。本研究阐明围绝经期雌激素受体表达下降，其调节TPH2和MAOA的转录水平，最终导致5-HT含量降低，为围绝经期疾病的临床诊断和治疗提供了新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 围绝经期（OVX）小鼠脑中5-HT能神经通路（5-HT、5-HT1AR、5-HT2AR）如何变化，以及雌激素受体是否通过调节5-HT代谢酶参与这些变化？
- 核心机制
- 围绝经期雌激素水平降低导致缝际核中ERα和ERβ表达下降，ERα/β作为转录因子正向调节TPH2和MAOA的转录，进而影响5-HT合成，最终引起5-HT含量降低和5-HT受体表达改变，参与体温调节异常等围绝经期症状。
- 主要证据
- 全脑免疫组化显示OVX组5-HT阳性神经元和纤维减少，5-HT1AR和5-HT2AR在多个脑区（如POA、杏仁核）表达改变；CUT&Tag及双荧光素酶实验证实ERα/β调控TPH2和MAOA转录；体内注射ER激动剂/抑制剂改变5-HT水平及体温。
- 研究意义
- 为围绝经期疾病的临床诊断和治疗提供了新靶点（TPH2、MAOA），有望克服雌激素和SSRIs治疗的副作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测模型动物体表温度
评估OVX小鼠是否出现体温升高的围绝经期症状。
术后8周，对清醒小鼠用红外热像仪连续监测头部、背部、尾部和爪部的皮肤温度，每天下午测量，持续5天。
全脑免疫组化定位5-HT、5-HT1AR、5-HT2AR
绘制围绝经期小鼠全脑5-HT能神经通路图谱，比较OVX与Sham组的表达差异。
对每组5只小鼠脑组织进行50μm连续切片，用抗5-HT、5-HT1AR、5-HT2AR抗体进行免疫组化染色，全景扫描后选取10个代表性冠状面，计算各脑区阳性细胞数和平均光密度（AOD）。
检测缝际核中ERα、ERβ和GPR30的表达
探讨OVX后缝际核区雌激素受体表达的变化。
使用qPCR和Western blot检测Sham和OVX小鼠缝际核中ERα、ERβ、GPR30的mRNA和蛋白表达水平。
CUT&Tag鉴定ERα/β在全基因组结合位点
鉴定缝际核中ERα和ERβ作为转录因子结合的靶基因，特别是与5-HT代谢相关的基因。
取Sham组15只小鼠的缝际核组织，制备单细胞核悬液，用CUT&Tag试剂盒进行实验，使用ERα、ERβ、histone H3抗体和IgG对照，测序后进行生物信息学分析。
双荧光素酶报告实验验证ERα/β对TPH2和MAOA的转录调控
验证CUT&Tag发现的ERα/β结合位点是否确实调控TPH2和MAOA的转录活性。
使用SY5Y细胞，共转染pCDNA3.1(+)表达ESR1或ESR2的质粒和pGL3-promoter含结合位点的质粒，以及pRL-TK内参质粒，进行双荧光素酶活性检测。
体内验证ERα/β对TPH2、MAOA表达和体温的影响
在体内通过立体定位注射ER激动剂/抑制剂，验证ERα/β对RN中TPH2、MAOA表达及5-HT水平和体温的调控作用。
将ERα/β激动剂或抑制剂注入OVX或Sham小鼠的缝际核，3天后测量体温，然后取材检测RN中5-HT、MAOA浓度（ELISA），TPH2、MAOA蛋白（WB）和mRNA（qPCR）水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 三溴乙醇 | -- | -- |
| 呋喃西林 | -- | -- | |
| 动物模型验证 | ELISA试剂盒 | Furuirunze | -- |
| 体温测量 | 红外热像仪 | FOTRIC | -- |
| 免疫组化 | 抗5-HT抗体 | Abcam | ab6336 |
| 抗5-HT1AR抗体 | Novus | NBP2-21590 | |
| 抗5-HT2AR抗体 | Abcam | ab66049 | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | PV9004 | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | SP9001 | |
| 阳离子防脱片 | ZSGB-BIO | ZLI-9506 | |
| 病理切片扫描仪 | WISLEAP | WS-10 | |
| 二甲苯 | -- | -- | |
| 中性树胶 | -- | -- | |
| 立体定位注射 | 丙基吡唑三醇 | MedChemExpress | HY-100689 |
| AZD9496 | MedChemExpress | HY-12870 | |
| 甘草素 | MedChemExpress | HY-N0377 | |
| PHTPP | MedChemExpress | HY-103456 | |
| 微量注射器 | Hamilton | 7632-01 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Applygen | C1053+ |
| 磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂 | Applygen | P1265 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Applygen | P1511-2 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Biotides | WB1102 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 脱脂奶粉 | Applygen | P1022-500 | |
| 超敏ECL化学发光液 | Applygen | P1010-250 | |
| 抗ERα抗体 | ABclonal | A12976 | |
| 抗ERβ抗体 | Bioss | bs-0116R | |
| 抗GPR30抗体 | Bioss | bs-1380R | |
| 抗MAOA抗体 | ABclonal | A1354 | |
| 抗TPH2抗体 | ABclonal | A14520 | |
| 抗GAPDH抗体 | Applygen | C1312 | |
| qPCR | TransZol Up Plus RNA试剂盒 | Transgene | ER501-01 |
| TransScript Uni 逆转录试剂盒 | Transgene | AU341-02 | |
| qPCR SuperMix（一步法去除基因组DNA） | Transgene | AQ602-22 | |
| CUT&Tag | 细胞核提取试剂盒 | Solarbio | SN0020 |
| CUT&Tag试剂盒 | Novezan Vazyme | TD903 | |
| 抗ERα抗体 | Abcam | ab32063 | |
| 抗ERβ抗体 | Novus | NB200-305 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | #4620 | |
| 免疫球蛋白G | Beyotime | A7016 | |
| 双荧光素酶实验 | 高纯度大提质粒试剂盒 | Tiangen | DP116 |
| 双荧光素酶检测试剂盒 | Genomeditech | -- | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OVX模型构建 | 小鼠品系、周龄、体重、分组样本量、麻醉剂量、手术方式、术后处理、模型成功标准（阴道涂片、血清雌二醇） 阅读提示：见Materials and methods 2.1-2.2节及Fig.1 |
| 体温测量 | 测量时间（下午）、环境温度、测量时长、各组样本量、麻醉状态（清醒） 阅读提示：见Materials and methods 2.3节及Fig.2 |
| 免疫组化 | 切片厚度、抗体稀释比例、抗原修复条件、显色时间、图像分析方法（AOD） 阅读提示：见Materials and methods 2.4节及Fig.3-10 |
| 立体定位注射 | 注射坐标、药物浓度和剂量、注射体积、溶剂组成、注射后测量时间 阅读提示：见Materials and methods 2.5节及Table 2 |
| CUT&Tag | 样本量（n=15）、细胞核数量、抗体及稀释、测序平台、数据分析方法 阅读提示：见Materials and methods 2.8节及Fig.13-15 |
| 双荧光素酶实验 | 细胞系、质粒构建、转染方法、内参质粒、检测试剂盒、独立实验重复数 阅读提示：见Materials and methods 2.9节及Fig.15 |