circRNA-5335通过miR-125a-3p/STAT3通路调控绵羊前体脂肪细胞的分化和增殖

CircRNA-5335 Regulates the Differentiation and Proliferation of Sheep Preadipocyte via the miR-125a-3p/STAT3 Pathway.

作者信息Wei Guo, Renzeng Ciwang, Lei Wang, Shuer Zhang, Nan Liu, Jinshan Zhao, Lisheng Zhou, Hegang Li, Xiaoxiao Gao, Jianning He
PMID38393088
期刊Vet Sci
发布时间2024-02
DOI10.3390/vetsci11020070

实验完整度

包含体外细胞实验(分离培养绵羊前体脂肪细胞)、功能验证(siRNA敲低、过表达)、机制研究(双荧光素酶报告基因、Western blot、RT-qPCR)以及细胞增殖分化检测(CCK8、EdU、油红O染色),多个独立证据层级。

主要模型

绵羊肌内前体脂肪细胞(3日龄公羊背最长肌分离) 293T细胞(双荧光素酶报告基因)

重点核对

绵羊前体脂肪细胞的分离:来自3日龄公羊背最长肌,0.2%胶原酶Ⅱ消化 细胞培养条件:90% DMEM/F12 + 10% FBS + 5%青霉素-链霉素,37°C, 5% CO2, 95%湿度 前体脂肪细胞分化诱导:IBMX (0.5 mmol/L)、DEX (1 μmol/L)、INS (10 μg/mL),共8天 miR-125a-3p mimic/inhibitor转染及siRNA敲低验证 双荧光素酶报告基因验证结合位点

摘要

简单总结:羊肉是高品质蛋白质和营养素的流行来源。由于其低胆固醇水平和高营养价值,它被认为是一种绿色食品。充足的肌内脂肪可以增加大理石花纹,降低剪切力,并改善肉的味道和适口性。肌内白色脂肪细胞是由前体脂肪细胞分化产生的。肌内脂肪的含量与肉质直接相关。前体脂肪细胞对肌内脂肪含量的影响与前体脂肪细胞的增殖和分化密切相关。因此,对前体脂肪细胞的研究越来越深入。在细胞和分子水平上研究circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3网络的表达对于通过改善脂肪形成来提高羊肉品质至关重要。 摘要:前体脂肪细胞产生的肌内脂肪(IMF)含量与家畜的肉质成正比。然而,circRNAs在绵羊IMF沉积中的作用尚不清楚。在本研究中,我们展示了circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3在绵羊前体脂肪细胞的增殖和分化中发挥重要的调节作用。在这项研究中,我们表征了从不同月龄绵羊中筛选并基于测序数据的差异表达circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3的作用。首先,通过RT-qPCR和WB鉴定了circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3在前体脂肪细胞体外分化过程中的表达谱。然后,通过双荧光素酶报告基因实验验证了circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3的靶向关系。RT-qPCR、CCK8、EdU和油红O染色结果表明,miR-125a-3p通过靶向STAT3抑制了前体脂肪细胞的分化并促进了增殖。作为竞争性内源RNA,circRNA-5335的下调通过增加miR-125a-3p降低了STAT3的表达,从而抑制了前体脂肪细胞的分化并促进了增殖。我们目前的研究证明了circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3在绵羊前体脂肪细胞分化中的功能意义,并为探索IMF的机制提供了新的见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3通路在绵羊前体脂肪细胞增殖和分化中的作用及其机制是什么?
核心机制
circRNA-5335作为miR-125a-3p的海绵,竞争性结合miR-125a-3p,解除其对STAT3的抑制,从而上调STAT3表达,促进前体脂肪细胞分化并抑制增殖。
主要证据
双荧光素酶报告基因验证circRNA-5335与miR-125a-3p、miR-125a-3p与STAT3的靶向关系;siRNA敲低circRNA-5335或STAT3后,通过RT-qPCR、Western blot检测分化标记基因(PPARG、C/EBPA)和增殖标记基因(PCNA)表达,以及油红O染色、CCK8和EdU实验评估分化与增殖。
研究意义
研究揭示了circRNA-5335/miR-125a-3p/STAT3轴在绵羊肌内脂肪形成中的功能,为改善羊肉品质提供了新途径,并可能作为分子标记用于筛选优质肉羊。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

前体脂肪细胞分离与培养

获取绵羊肌内前体脂肪细胞用于后续实验

从3日龄公羊背最长肌分离前体脂肪细胞,经胶原酶消化、离心、过滤后培养

2

前体脂肪细胞分化诱导

诱导前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化,用于检测基因表达和脂滴形成

细胞汇合至70%时转染,分化培养:先2天用IBMX、DEX、INS处理,再2天用INS处理,之后每2天换液,共8天

3

基因敲低与过表达

验证STAT3、miR-125a-3p、circRNA-5335的功能

使用siRNA-STAT3、miR-125a-3p mimic/inhibitor、siRNA-circRNA-5335转染前体脂肪细胞

4

靶向关系验证

验证circRNA-5335与miR-125a-3p、miR-125a-3p与STAT3之间的直接结合

构建野生型和突变型PmirGLO质粒,共转染293T细胞,使用双荧光素酶报告基因检测荧光活性

5

基因与蛋白表达检测

检测各处理组中目标基因和蛋白的表达水平,评估分化与增殖标志物

RNA提取、RT-qPCR检测mRNA和miRNA表达;蛋白提取、Western blot检测蛋白水平

6

细胞功能检测

评估前体脂肪细胞的增殖与分化能力

使用油红O染色检测脂滴形成;CCK8和EdU检测细胞增殖;Image J定量分析

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
磷酸盐缓冲液hycloneSH30256.01
胶原酶ⅡSolarbioC8150
DMEM/F12培养基hycloneSH30023.01
胎牛血清Gibco10099-141
青霉素-链霉素hycloneSV30010
脂质体转染试剂3000Thermo FisherL3000015
双荧光素酶报告基因检测试剂盒VazymeDL101-01
发光检测仪PromegaGLOMAX-20/20
TRIzol试剂Takara9108
核糖核酸酶RGeneseedR0301
逆转录试剂盒VazymeR312-01
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤SigmaI7018
地塞米松SigmaD4902
胰岛素SolarbioI8830
油红O染色试剂盒SolarbioG1262
细胞计数试剂盒8Beyotime40203ES76
EdU细胞增殖检测试剂盒(Alexa Fluor 488)BeyotimeC0071S
Axio scope A1显微镜ZEISS--
RIPA裂解液SolarbioR0020
BCA蛋白定量试剂盒SolarbioPC0020
SDS-PAGE凝胶BeyotimeP0015L
PVDF膜MilliporeIPVH00010
发光成像系统InvitrogeniBright FL 1000
GAPDH抗体ABclonalAC027
彩色混合蛋白分子量标准SolarbioPR1920
预染蛋白分子量标准VazymeMP102
STAT3抗体BeyotimeAF1492
磷酸化STAT3抗体Biossbs1658R
磷酸化STAT3抗体ABclonalAP0474
PCNA抗体ABclonalA0264
山羊抗兔IgG抗体Abcamab97051

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
前体脂肪细胞分离与培养
细胞来源:3日龄公羊背最长肌;分离方法:0.2%胶原酶Ⅱ消化、离心1000 rpm 5 min;培养条件:90% DMEM/F12 + 10% FBS + 5% P/S,37°C,5% CO2,95%湿度
阅读提示:见2.1节
分化诱导
分化培养基成分和浓度、处理时间:IBMX (0.5 mmol/L) + DEX (1 μmol/L) + INS (10 μg/mL) 处理2天,之后INS (10 μg/mL) 处理2天,第8天结束
阅读提示:见2.4节
基因敲低与过表达
siRNA-STAT3、miR-125a-3p mimic/inhibitor、siRNA-circRNA-5335的转染试剂(Lipofectamine 3000)、转染浓度(文中未明确说明)
阅读提示:见2.2节及结果部分
双荧光素酶报告基因
293T细胞、PmirGLO质粒(野生型/突变型)、转染分组、荧光素酶检测试剂盒(DL101-01)
阅读提示:见2.2节
RT-qPCR
引物序列(表1、表2)、内参基因(GAPDH、U6)、反应条件(95°C 30s;40循环95°C 5s,60°C 30s)
阅读提示:见2.7节,表1、表2
Western blot
抗体信息(STAT3、P-STAT3、PCNA、GAPDH)、蛋白定量(BCA)、上样量(文中未明确说明)
阅读提示:见2.8节
细胞增殖检测
CCK8检测波长450 nm、EdU检测试剂盒、显微镜型号
阅读提示:见2.6节
统计分析
重复次数(至少3次独立实验)、统计方法(单因素方差分析,p<0.05)、软件(SPSS 26.0)
阅读提示:见2.9节