前体脂肪细胞分离与培养
获取绵羊肌内前体脂肪细胞用于后续实验
从3日龄公羊背最长肌分离前体脂肪细胞,经胶原酶消化、离心、过滤后培养
CircRNA-5335 Regulates the Differentiation and Proliferation of Sheep Preadipocyte via the miR-125a-3p/STAT3 Pathway.
包含体外细胞实验(分离培养绵羊前体脂肪细胞)、功能验证(siRNA敲低、过表达)、机制研究(双荧光素酶报告基因、Western blot、RT-qPCR)以及细胞增殖分化检测(CCK8、EdU、油红O染色),多个独立证据层级。
绵羊肌内前体脂肪细胞(3日龄公羊背最长肌分离) 293T细胞(双荧光素酶报告基因)
绵羊前体脂肪细胞的分离:来自3日龄公羊背最长肌,0.2%胶原酶Ⅱ消化 细胞培养条件:90% DMEM/F12 + 10% FBS + 5%青霉素-链霉素,37°C, 5% CO2, 95%湿度 前体脂肪细胞分化诱导:IBMX (0.5 mmol/L)、DEX (1 μmol/L)、INS (10 μg/mL),共8天 miR-125a-3p mimic/inhibitor转染及siRNA敲低验证 双荧光素酶报告基因验证结合位点
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取绵羊肌内前体脂肪细胞用于后续实验
从3日龄公羊背最长肌分离前体脂肪细胞,经胶原酶消化、离心、过滤后培养
诱导前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化,用于检测基因表达和脂滴形成
细胞汇合至70%时转染,分化培养:先2天用IBMX、DEX、INS处理,再2天用INS处理,之后每2天换液,共8天
验证STAT3、miR-125a-3p、circRNA-5335的功能
使用siRNA-STAT3、miR-125a-3p mimic/inhibitor、siRNA-circRNA-5335转染前体脂肪细胞
验证circRNA-5335与miR-125a-3p、miR-125a-3p与STAT3之间的直接结合
构建野生型和突变型PmirGLO质粒,共转染293T细胞,使用双荧光素酶报告基因检测荧光活性
检测各处理组中目标基因和蛋白的表达水平,评估分化与增殖标志物
RNA提取、RT-qPCR检测mRNA和miRNA表达;蛋白提取、Western blot检测蛋白水平
评估前体脂肪细胞的增殖与分化能力
使用油红O染色检测脂滴形成;CCK8和EdU检测细胞增殖;Image J定量分析
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离与培养 | 磷酸盐缓冲液 | hyclone | SH30256.01 |
| 胶原酶Ⅱ | Solarbio | C8150 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | hyclone | SH30023.01 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青霉素-链霉素 | hyclone | SV30010 | |
| 细胞转染 | 脂质体转染试剂3000 | Thermo Fisher | L3000015 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | DL101-01 |
| 发光检测仪 | Promega | GLOMAX-20/20 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | 9108 |
| circRNA鉴定 | 核糖核酸酶R | Geneseed | R0301 |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | Vazyme | R312-01 |
| 分化诱导 | 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | I7018 |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 胰岛素 | Solarbio | I8830 | |
| 油红O染色 | 油红O染色试剂盒 | Solarbio | G1262 |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒8 | Beyotime | 40203ES76 |
| EdU细胞增殖检测试剂盒(Alexa Fluor 488) | Beyotime | C0071S | |
| Axio scope A1显微镜 | ZEISS | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | P0015L | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 发光成像系统 | Invitrogen | iBright FL 1000 | |
| GAPDH抗体 | ABclonal | AC027 | |
| 彩色混合蛋白分子量标准 | Solarbio | PR1920 | |
| 预染蛋白分子量标准 | Vazyme | MP102 | |
| STAT3抗体 | Beyotime | AF1492 | |
| 磷酸化STAT3抗体 | Bioss | bs1658R | |
| 磷酸化STAT3抗体 | ABclonal | AP0474 | |
| PCNA抗体 | ABclonal | A0264 | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | Abcam | ab97051 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 前体脂肪细胞分离与培养 | 细胞来源:3日龄公羊背最长肌;分离方法:0.2%胶原酶Ⅱ消化、离心1000 rpm 5 min;培养条件:90% DMEM/F12 + 10% FBS + 5% P/S,37°C,5% CO2,95%湿度 阅读提示:见2.1节 |
| 分化诱导 | 分化培养基成分和浓度、处理时间:IBMX (0.5 mmol/L) + DEX (1 μmol/L) + INS (10 μg/mL) 处理2天,之后INS (10 μg/mL) 处理2天,第8天结束 阅读提示:见2.4节 |
| 基因敲低与过表达 | siRNA-STAT3、miR-125a-3p mimic/inhibitor、siRNA-circRNA-5335的转染试剂(Lipofectamine 3000)、转染浓度(文中未明确说明) 阅读提示:见2.2节及结果部分 |
| 双荧光素酶报告基因 | 293T细胞、PmirGLO质粒(野生型/突变型)、转染分组、荧光素酶检测试剂盒(DL101-01) 阅读提示:见2.2节 |
| RT-qPCR | 引物序列(表1、表2)、内参基因(GAPDH、U6)、反应条件(95°C 30s;40循环95°C 5s,60°C 30s) 阅读提示:见2.7节,表1、表2 |
| Western blot | 抗体信息(STAT3、P-STAT3、PCNA、GAPDH)、蛋白定量(BCA)、上样量(文中未明确说明) 阅读提示:见2.8节 |
| 细胞增殖检测 | CCK8检测波长450 nm、EdU检测试剂盒、显微镜型号 阅读提示:见2.6节 |
| 统计分析 | 重复次数(至少3次独立实验)、统计方法(单因素方差分析,p<0.05)、软件(SPSS 26.0) 阅读提示:见2.9节 |