验证P4对KGN细胞的抗凋亡作用
确认P4能否抑制人颗粒细胞凋亡，并观察内源性P4被抑制后的影响。
KGN细胞分别用P4（1 µM）、AG（0.2 µM）、P4+AG处理24小时，检测凋亡率及凋亡相关蛋白表达。
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孕激素和脂联素受体7（PAQR7）介导P4对人颗粒细胞的抗凋亡作用，其缺乏会降低雌性小鼠的卵巢功能
Progestin and adipoQ receptor 7 (PAQR7) mediate the anti-apoptotic effect of P4 on human granulosa cells and its deficiency reduces ovarian function in female mice.
实验完整度
高包含体外KGN细胞敲降与凋亡检测、Paqr7敲除小鼠体内功能验证、患者样本及DOR小鼠模型表达分析，并涉及机制通路验证。
主要模型
人颗粒细胞系KGN Paqr7敲除小鼠（C57BL/6J） DOR患者卵泡液来源颗粒细胞 DOR样表型小鼠模型（TPT处理）
重点核对
KGN细胞中siPAQR7敲降效率约70%，伴随P4（1 µM）或AG（0.2 µM）处理 Paqr7−/−小鼠的构建使用CRISPR-Cas9，删除812 bp，确认mRNA和蛋白缺失 动情周期监测连续12天，激素检测在动情间期或动情前期进行 生育力评估：每笼一雄一雌配对，记录约6个月的产仔数和每窝仔数 患者分组依据博洛尼亚标准和ESHRE指南，样本量DOR和NOR每组n=11
摘要
目的：PAQR7作为孕酮膜受体在细胞凋亡中发挥关键作用。PAQR7在哺乳动物卵巢功能中的生理机制及其抗凋亡作用仍知之甚少。方法：我们首先添加0.2 µM氨基谷鲁米特（AG）——一种内源性孕酮（P4）分泌的抑制剂，并在人KGN细胞中与P4共孵育转染siPAQR7，分别鉴定颗粒细胞凋亡。此外，我们使用Paqr7敲除（PAQR7 KO）小鼠评估PAQR7在卵巢中的作用。结果：PAQR7缺乏显著增加KGN细胞凋亡，而补充P4后这一显著差异消失。Paqr7−/−雌性小鼠表现出动情周期延长、卵泡生长减少、闭锁卵泡数量增加，以及E2和AMH浓度降低。与Paqr7+/+小鼠相比，Paqr7−/−小鼠的产仔数、每窝仔数和自发排卵显著减少。此外，我们还发现从诊断为卵巢储备功能减退（DOR）的患者卵泡液和具有DOR样表型的小鼠卵巢中分离的颗粒细胞中PAQR7表达低。结论：本研究已确定PAQR7参与小鼠卵巢功能和受精潜力。一种可能的机制是通过BCL-2/BAX/CASPASE-3信号通路介导P4对GC凋亡的抗凋亡作用。PAQR7对卵巢发育和衰老的影响机制仍有待确定。补充信息：在线版本包含补充材料，可访问10.1186/s13048-024-01348-w。关键词：凋亡，颗粒细胞，卵巢功能，孕酮，孕激素和脂联素受体7(PAQR7)
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAQR7是否介导孕酮（P4）对人颗粒细胞的抗凋亡作用，并影响卵巢功能？
- 核心机制
- PAQR7通过BCL-2/BAX/CASPASE-3信号通路介导P4的抗凋亡作用。
- 主要证据
- 体外KGN细胞敲低PAQR7增加凋亡并改变凋亡相关蛋白表达，Paqr7敲除小鼠出现卵巢功能下降、凋亡增加及生育力降低，且DOR患者和DOR样小鼠中PAQR7表达下调。
- 研究意义
- 该研究可能为延缓卵巢衰老的发生提供新的见解，并为临床治疗卵巢早衰、女性不孕等疾病提供潜在的治疗方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低PAQR7验证其介导P4的抗凋亡作用
探究PAQR7缺失是否影响P4的抗凋亡效果及凋亡相关信号通路。
将siPAQR7或对照siRNA转染KGN细胞，并部分组加入P4共孵育，检测凋亡、PAQR7表达及BCL2/BAX/CASPASE-3。
构建Paqr7敲除小鼠并评估生育力
研究PAQR7缺失对雌性小鼠生育力和自发排卵的影响。
使用CRISPR-Cas9构建Paqr7−/−小鼠，与野生型配对观察6个月产仔情况，并检查阴道栓后收集卵母细胞计数。
评估Paqr7敲除对卵巢组织学与卵泡发育的影响
确定PAQR7缺失是否导致卵巢形态异常和卵泡发育受阻。
取2月龄小鼠卵巢进行HE染色，统计各阶段卵泡数量（原始、初级、次级、窦状、闭锁）。
检测生殖内分泌激素水平
评估PAQR7缺失对雌二醇、AMH、FSH和孕酮等激素水平的影响。
在动情间期或动情前期采集血清，ELISA检测AMH、E2、P4和FSH浓度。
检测卵巢组织凋亡与氧化应激
验证PAQR7缺失是否增加卵巢细胞凋亡并伴随氧化应激。
使用TUNEL染色检测凋亡，Western blot和RT-qPCR检测Bcl2、Bax、Caspase-3，使用ROS探针检测氧化应激。
验证DOR患者及DOR样小鼠中PAQR7表达
探明PAQR7表达下调是否与临床DOR相关。
从DOR患者（n=8）和对照组（n=11）卵泡液分离颗粒细胞，Western blot检测PAQR7蛋白水平；构建DOR样小鼠模型（TPT处理），检测卵巢PAQR7表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素-庆大霉素添加剂 | -- | -- | |
| 药物处理 | 氨基谷鲁米特 | MCE | HY-B0237 |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| 细胞转染 | PAQR7 siRNA | Ribobio | SIGS0016288-1 |
| 凋亡检测 | Annexin V探针试剂盒 | Beyotime | -- |
| DAPI | Solarbio | C0065-50 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MedChemexpress | HY-K0010 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Sigma-Aldrich | IPVH00010 | |
| 抗PAQR7抗体 | Bioss | bs-17741R | |
| 抗Bcl2抗体 | Proteintech | 26593-1-AP | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗cleaved-Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | #9664 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Uelandy | S6009M | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript™ RT试剂盒 | TaKaRa | RR047A | |
| SYBR Green试剂 | TaKaRa | RR430A | |
| CFX96实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 激素检测 | FSH ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0511c |
| E2 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0150c | |
| AMH ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3015 | |
| TUNEL检测 | 一步法TUNEL原位凋亡试剂盒 | Elabscience | E-CK-A320 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | D7008 |
| 动物实验 | 雷公藤多苷片 | De Ende Pharmaceutical Co. LTD | -- |
| 卵巢组织处理 | M2培养液 | -- | -- |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 切片 | 切片机RM2255 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | 细胞系：KGN；处理组：对照组、P4 (1 µM)、AG (0.2 µM)、P4+AG；siRNA转染效率；转染后培养时间 阅读提示：方法 'Cell culture and treatments' 和 'Apoptosis' |
| paqr7敲除小鼠构建 | 基因编辑方法：CRISPR-Cas9；gRNA序列；后代鉴定方法：PCR和Western blot；小鼠周龄 阅读提示：方法 'Animals' 中的Paqr7敲除小鼠构建部分 |
| 生育力评估 | 配对方式：一雄一雌；观察时间约6个月；记录产仔数和每窝仔数；笼数每组7 阅读提示：方法 'The fertility rate of Paqr7−/− female mice' |
| 激素检测 | 采血时间：动情间期或动情前期；小鼠月龄2个月；各组n=3；检测方法ELISA 阅读提示：方法 'Measurement of hormone levels' |
| 组织学分析 | 小鼠月龄2个月；切片厚度5 μm；染色方法HE；卵泡计数标准 阅读提示：方法 'Histological analysis of ovarian tissue and ovarian follicle counts' |