建立百草枯中毒大鼠模型
模拟百草枯中毒引起的肺纤维化过程。
将27只SD大鼠随机分为对照组、PQ低剂量组和PQ高剂量组，分别给予蒸馏水或10mg/kg、50mg/kg的百草枯，第3天处死，收集肺组织和血液。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
除草剂百草枯经Keap1/Nrf2信号通路诱导铁死亡导致肺纤维化的分子机制
Molecular mechanism of paraquat-induced ferroptosis leading to pulmonary fibrosis mediated by Keap1/Nrf2 signaling pathway.
实验完整度
高研究包含大鼠体内模型、组织病理学、生化检测、转录组学和蛋白质组学等多层次证据，并进行了功能验证和机制探讨。
主要模型
SD大鼠百草枯中毒模型
重点核对
模型：雄性SD大鼠，8-10周龄，体重280-320g 分组：对照组（FC）、PQ低剂量组（FL，10mg/kg）、PQ高剂量组（FH，50mg/kg） 给药方式：灌胃给予PQ或蒸馏水，第3天处死 样本量：每组至少6个平行样本 检测指标：肺组织病理、铁含量、铁死亡标志物（TFR1、DMT1、GPX4、FTH1/FTL等）、Keap1/Nrf2表达
摘要
百草枯（PQ）是一种广泛使用且毒性极强的除草剂，常被主动摄入并导致患者肺纤维化。铁死亡是一种受调控的非凋亡性细胞死亡形式，与铁依赖性脂质过氧化相关。既往研究表明，铁死亡参与急性肺损伤（ALI）的发生和发展。本研究通过给予PQ成功建立了具有炎症反应、氧化应激、脂质过氧化和肺纤维化的大鼠模型。通过TUNEL染色、铁离子检测和铁死亡相关生物标志物检测，证实了PQ模型大鼠中发生铁死亡。Western blotting（WB）和实时荧光定量PCR（RT-PCR）显示，PQ大鼠肺组织中Keap1表达显著上调，Nrf2表达显著下调。进一步的转录组学和蛋白质组学证实：（1）铁离子结合相关分子过程富集；（2）Keap1可能促进Nrf2泛素化并导致Nrf2降解；（3）铁死亡相关通路存在功能富集。我们的结果表明，PQ可调控Keap1/Nrf2信号通路，导致脂质过氧化增加和铁摄取异常，从而诱导铁死亡并加剧肺纤维化的进展。我们的研究为PQ诱导的肺纤维化提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 百草枯中毒是否通过调控Keap1/Nrf2信号通路诱导铁死亡进而导致肺纤维化？
- 核心机制
- 百草枯上调Keap1表达，促进Nrf2泛素化降解，导致Nrf2下调，失去对铁转运蛋白表达的抑制，引起铁摄取异常和脂质过氧化，诱导铁死亡，加剧肺纤维化。
- 主要证据
- 大鼠模型显示PQ引起肺纤维化、炎症、氧化应激和脂质过氧化；TUNEL染色和铁含量升高及铁死亡标志物变化证实铁死亡；WB和RT-PCR显示Keap1上调、Nrf2下调；转录组和蛋白质组富集到铁死亡通路及铁离子结合过程。
- 研究意义
- 为理解PQ毒性机制提供新参考，并为治疗PQ中毒引起的肺纤维化提供潜在的筛选靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测肺纤维化及病理特征
验证PQ诱导的肺纤维化及上皮间质转化。
通过透射电镜观察肺组织超微结构，天狼星红染色检测胶原沉积，ELISA检测纤维化标志物，免疫荧光检测α-SMA和Collagen 1表达。
检测炎症与氧化应激
评估PQ诱导的炎症反应和氧化应激水平。
ELISA检测血清炎症因子，使用试剂盒检测肺组织ROS、MDA和GSH水平。
验证铁死亡的发生
确认PQ诱导的细胞死亡是否为铁死亡。
通过TUNEL染色检测细胞死亡，测定肺组织铁含量，并检测铁死亡相关标志物（TFR1、DMT1、GPX4、FTH1/FTL、NQO1）的mRNA和蛋白表达。
检测Keap1/Nrf2信号通路变化
探究PQ中毒对Keap1/Nrf2信号通路的影响。
通过RT-qPCR和Western blot检测肺组织中Keap1和Nrf2的mRNA和蛋白表达。
转录组学分析
在基因水平揭示PQ暴露的潜在作用机制。
对肺组织进行转录组测序，分析差异基因，并进行KEGG通路富集分析。
蛋白质组学分析
在蛋白水平揭示PQ暴露的潜在作用机制。
对肺组织进行蛋白质组学分析，鉴定差异蛋白，并进行功能富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织学检测 | 透射电子显微镜 | FEI | -- |
| 免疫荧光 | I型胶原抗体 | Abcam | EPR24331-53 |
| α-SMA抗体 | Zsbg-bio | -- | |
| DAPI溶液 | Servicebio | G1012 | |
| 氧化应激检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| MDA比色生化试剂盒 | Nanjing Institute of Biological Engineering | -- | |
| GSH比色生化试剂盒 | Nanjing Institute of Biological Engineering | -- | |
| 炎症因子检测 | 大鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKR-0024 |
| 大鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKR-0005 | |
| 大鼠MCP-1 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKR-0024 | |
| 大鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKR-0009 | |
| 凋亡检测 | TransDetect®原位荧光TUNEL凋亡检测试剂盒 | -- | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| GPX4抗体 | Abcam | -- | |
| TRF1抗体 | Abcam | -- | |
| DMT1抗体 | Abcam | -- | |
| FTL抗体 | Abcam | -- | |
| Nrf2抗体 | Abcam | -- | |
| Keap1抗体 | Abcam | -- | |
| 磷酸化GSK-3β抗体 | Abcam | -- | |
| Fyn抗体 | Abcam | -- | |
| Nqo1抗体 | Abcam | -- | |
| 羊抗兔IgG-HRP | Bioss | -- | |
| 羊抗小鼠IgG-HRP | Bioss | -- | |
| ECL底物 | -- | -- | |
| 凝胶图像分析系统 | Tanon | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- | |
| SYBR®Green试剂盒 | TaKaRa | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠品系、周龄、体重、PQ剂量、给药方式、处死时间 阅读提示：见Methods中'Experimental animals'和'Animal grouping and experimental procedure' |
| 组织病理学 | 固定液、切片厚度、染色方法 阅读提示：见Methods中'Histopathological analysis and sirian red staining' |
| 铁死亡验证 | TUNEL检测试剂盒、铁含量测定方法、标志物及其检测方法 阅读提示：见Methods中'TUNEL assay'和'Analysis of iron content'以及Results中'Ferroptosis induced by PQ exposure in rats' |
| Keap1/Nrf2信号通路检测 | 抗体来源、稀释比例、内参基因、检测方法 阅读提示：见Methods中'Western blotting'和'Real-time fluorescence quantitative PCR' |
| 转录组和蛋白质组学 | 样本处理、测序和分析平台、差异基因/蛋白筛选标准 阅读提示：见Methods中'Transcriptomic analysis'和'Proteomic analysis'以及补充材料Method S1和S2 |