构建缺血性卒中模型
建立小鼠短暂大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型，模拟缺血性卒中。
通过结扎右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，插入尼龙线阻塞大脑中动脉60分钟，然后恢复灌注。
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USP10是迷走神经刺激通过抑制NF-κB信号通路减轻缺血性卒中神经炎症的潜在介质
USP10 is a potential mediator for vagus nerve stimulation to alleviate neuroinflammation in ischaemic stroke by inhibiting NF-κB signalling pathway.
实验完整度
高包含体外细胞模型、小鼠tMCAO模型、免疫组化、Western blot、流式细胞术等，并进行了功能验证（USP10沉默）和机制验证（NF-κB通路）。
主要模型
小鼠tMCAO模型 原代小胶质细胞 星形胶质细胞
重点核对
USP10表达时间点（2h, 6h, 24h, 48h, 72h, 7d） VNS刺激参数（0.5 mA, 5 Hz, 30秒/5分钟, 持续1小时） LV-shUSP10注射坐标（AP +0.5 mm; L -2.0 mm; V -3.0 mm 皮层和 V -1.5 mm 纹状体） 神经功能评分（Longa评分, mNSS, 转棒实验） 脑梗死体积测定（TTC染色）
摘要
背景：迷走神经刺激（VNS）对缺血性卒中的神经功能恢复具有保护作用。然而，其潜在机制仍有待阐明。泛素特异性蛋白酶10（USP10）是泛素特异性蛋白酶家族的成员，已被证明能抑制NF-κB信号通路的激活。因此，本研究探讨USP10是否在VNS对抗缺血性卒中的保护作用中发挥关键作用，并探讨其机制。方法：通过短暂大脑中动脉闭塞（tMCAO）构建小鼠缺血性卒中模型。在tMCAO模型建立后30分钟、24小时和48小时进行VNS。检测VNS诱导的tMCAO后USP10的表达。采用立体定位注射技术，用LV-shUSP10建立USP10低表达模型。评估VNS伴或不伴USP10沉默对神经功能缺损、脑梗死体积、NF-κB通路激活、胶质细胞激活和促炎细胞因子释放的影响。结果：VNS增强了tMCAO后USP10的表达。VNS改善了神经功能缺损并减少了脑梗死体积，但这一效应被USP10沉默所抑制。VNS抑制了tMCAO诱导的NF-κB通路激活和炎症细胞因子的表达。此外，VNS促进了小胶质细胞从促炎向抗炎反应的转变，并抑制了星形胶质细胞的激活，而USP10沉默阻断了VNS的神经保护和抗神经炎症作用。结论：USP10是VNS通过抑制NF-κB信号通路减轻缺血性卒中神经功能缺损、神经炎症和胶质细胞激活的潜在介质。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探讨USP10是否在VNS对缺血性卒中的保护作用中发挥关键作用，并阐明其潜在机制。
- 核心机制
- VNS通过上调USP10表达，抑制NEMO的线性泛素化，进而抑制NF-κB信号通路的激活，从而减轻神经炎症。
- 主要证据
- 在小鼠tMCAO模型中，VNS上调USP10，抑制NF-κB通路激活，减少促炎细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）的表达，抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活；而USP10沉默阻断了这些效应。
- 研究意义
- 该研究表明，增加脑内USP10表达可能是预防缺血性卒中诱导的神经炎症反应及后续脑损伤的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
VNS干预
评估VNS对缺血性卒中的保护作用，并确定其对USP10表达的影响。
在tMCAO术后30分钟、24小时和48小时进行右侧颈迷走神经电刺激（0.5 mA, 5 Hz），每次30秒，每5分钟一次，持续1小时。
USP10表达检测
检测缺血性卒中后USP10的表达变化，以及VNS对其的影响。
通过Western blot、RT-qPCR和免疫荧光检测缺血半暗带皮层中USP10的mRNA和蛋白水平。
USP10沉默模型建立
通过LV-shUSP10沉默USP10表达，探究USP10在VNS保护作用中的必要性。
在tMCAO前两周，通过立体定位注射将LV-shUSP10注入皮层和纹状体，沉默USP10表达。
神经功能评估
评估VNS和USP10沉默对神经功能的影响。
在tMCAO后72小时，通过Longa评分、mNSS和转棒实验评估神经功能。
脑梗死体积检测
评估VNS和USP10沉默对脑梗死体积的影响。
通过TTC染色检测脑梗死体积。
NF-κB通路激活检测
检测VNS和USP10沉默对NF-κB信号通路的影响。
通过Western blot检测USP10、IκBα、p-IκBα、胞浆p65和核p65的表达，并通过免疫沉淀检测NEMO的线性泛素化水平。
小胶质细胞激活检测
评估VNS和USP10沉默对小胶质细胞激活和极化的影响。
通过免疫荧光和流式细胞术检测Iba-1、CD68、CD206等标记物，分析小胶质细胞形态和极化状态。
星形胶质细胞激活检测
评估VNS和USP10沉默对星形胶质细胞激活的影响。
通过免疫荧光检测GFAP表达，分析星形胶质细胞的数量、体积和初级突起数量。
炎症因子检测
评估VNS和USP10沉默对促炎细胞因子表达的影响。
通过RT-qPCR和ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 水合氯醛 | -- | -- |
| 激光多普勒血流仪 (PeriFlux 5000) | Perimed AB | -- | |
| 体内注射 | 含USP10 shRNA的慢病毒 | Genechem | -- |
| VNS治疗 | Grass Model S48刺激器 | Grass Technologies | -- |
| TTC染色 | 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 (TTC) | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 抗USP10单克隆兔抗体 | Cell Signaling Technology | 8501S | |
| 抗β-actin兔抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗IκBα兔抗体 | Cell Signaling Technology | 4812 | |
| 抗NF-κB p65兔抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化IκBα (Ser32)兔抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗Lamin B兔抗体 | Cell Signaling Technology | 17416 | |
| 免疫沉淀 | NEMO抗体 | Cell Signaling Technology | 2685 |
| 抗线性泛素抗体 | Millipore | ZRB2114 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Takara Biotechnology | -- |
| 逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| 免疫荧光 | 抗GFAP小鼠抗体 | Cell Signaling Technology | 80788 |
| 抗Iba-1鸡抗体 | SYSY | 234006 | |
| 抗CD68兔抗体 | Cell Signaling Technology | 97778 | |
| 抗CD206兔抗体 | Cell Signaling Technology | 24595 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG (H+L) | Proteintech | SA00006-1 | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗鸡IgY | Abcam | ab150171 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | Bioss | bs-0295G-AF488 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 神经组织解离试剂盒（胰蛋白酶） | Miltenyi Biotech | -- |
| CD11b-PE抗体 | eBioscience | 12-0112-82 | |
| CD45-Pacific Blue抗体 | eBioscience | MCD4528 | |
| CD68-APC抗体 | eBioscience | MA5-23616 | |
| CD206-APC-Cy7抗体 | LSBiO | LS-C732921 | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | BOSTER Co. | EK0527 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | BOSTER Co. | EK0394 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | BOSTER Co. | EK0411 | |
| 图像分析 | Image J软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系、体重、麻醉剂量、线栓阻塞时间、血流监测标准 阅读提示：见Materials and methods: Animals, Construction of the transient middle cerebral artery occlusion model |
| VNS治疗 | 刺激电流强度（0.5 mA）、频率（5 Hz）、刺激时间（30秒/5分钟，持续1小时）、时间点（30min, 24h, 48h） 阅读提示：见Materials and methods: VNS treatment |
| USP10沉默 | 慢病毒注射坐标、注射体积、速率、病毒滴度、注射时间（tMCAO前2周） 阅读提示：见Materials and methods: In vivo lentivirus injection |
| 神经功能评估 | Longa评分、mNSS评分、转棒实验的具体操作和时间（72h） 阅读提示：见Materials and methods: Neurobehavioural assessment |
| 脑梗死体积检测 | TTC浓度（2%）、染色时间（25分钟）、切片厚度（2mm） 阅读提示：见Materials and methods: TTC staining |
| NF-κB通路检测 | Western blot抗体稀释比例、免疫沉淀条件（NEMO抗体、线性泛素抗体） 阅读提示：见Materials and methods: Western blot, Immunoprecipitation |
| 小胶质细胞激活检测 | 免疫荧光标记物（Iba-1, CD68, CD206）、流式细胞术门控策略（CD11b+CD45int）、形态学分析参数 阅读提示：见Materials and methods: Immunofluorescence, Flow cytometry |
| 星形胶质细胞激活检测 | GFAP免疫荧光染色及参数（平均荧光强度、细胞体积、初级突起数量） 阅读提示：见Materials and methods: Immunofluorescence |
| 炎症因子检测 | RT-qPCR引物序列、ELISA试剂盒型号 阅读提示：见Materials and methods: RT−qPCR, Enzyme−linked immunosorbent assay |