检测NPB及其受体的表达
验证猪前脂肪细胞中是否存在NPB及其受体。
通过RT-qPCR和Western blot检测分化1天和6天的猪前脂肪细胞中NPB、NPBWR1和NPBWR2的mRNA和蛋白表达。
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神经肽B对猪白色前脂肪细胞增殖和分化为成熟脂肪细胞的影响
The Effects of Neuropeptide B on Proliferation and Differentiation of Porcine White Preadipocytes into Mature Adipocytes.
实验完整度
中采用原代细胞体外实验，包含增殖、分化、基因表达、蛋白和脂质积累检测，并使用p38抑制剂验证机制，但缺乏体内模型。
主要模型
猪白色前脂肪细胞原代培养
重点核对
NPB浓度为10和100 nmol/L 分化培养基含有850 nM胰岛素、10 nM地塞米松、2 nM三碘甲状腺原氨酸 p38抑制剂SB239063浓度为5 μmol/L 细胞分化时间1天和6天 细胞增殖检测时间24小时和48小时
摘要
神经肽B（NPB）通过结合并激活人和猪中的NPBWR1和NPBWR2来影响能量稳态和代谢。最近，我们报道NPB促进大鼠白色和棕色前脂肪细胞以及3T3-L1细胞的脂肪生成。在本研究中，我们评估了NPB对猪白色前脂肪细胞增殖和分化为成熟脂肪细胞的影响。我们在猪白色前脂肪细胞中鉴定了NPB、NPBWR1和NPBWR2在mRNA和蛋白质水平上的存在。在分化过程中，NPB增加了PPARγ、C/EBPβ、C/EBPα的mRNA表达以及PPARγ和C/EBPβ的蛋白产生。此外，NPB刺激了猪前脂肪细胞中的脂质积累。而且，NPB促进了猪前脂肪细胞中p38激酶的磷酸化，但未能诱导ERK1/2磷酸化。在p38抑制剂存在的情况下，NPB未能刺激C/EBPβ的表达。总之，我们报告NPB通过p38依赖性机制促进猪前脂肪细胞的分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 神经肽B（NPB）对猪白色前脂肪细胞增殖和分化为成熟脂肪细胞的影响及其潜在机制。
- 核心机制
- NPB通过p38依赖性机制促进猪前脂肪细胞的分化，涉及C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ的表达上调。
- 主要证据
- NPB促进猪前脂肪细胞增殖，增加分化标记基因表达、脂质积累，并诱导p38磷酸化；p38抑制剂SB239063阻断NPB的这些效应。
- 研究意义
- 研究为理解NPB在猪脂肪组织形成中的作用提供了证据，对动物育种计划中提高猪肉生产效率具有潜在意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估NPB对细胞增殖的影响
确定NPB是否影响猪前脂肪细胞的增殖。
将细胞用不同浓度NPB处理24或48小时，使用BrdU ELISA试剂盒检测增殖。
评估NPB对分化基因表达的影响
确定NPB是否调节脂肪生成相关转录因子的表达。
通过RT-qPCR检测分化1天和6天的细胞中C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ的mRNA表达，并通过Western blot检测PPARγ、C/EBPβ和FABP4蛋白水平。
评估NPB对脂质积累的影响
确定NPB是否促进前脂肪细胞分化中的脂质积累。
用油红O染色并定量脂质含量，在分化1天和6天后测定。
研究NPB的机制
确定NPB是否通过p38或ERK1/2信号通路发挥作用。
用NPB处理细胞不同时间，通过Western blot检测p38和ERK1/2磷酸化；用p38抑制剂SB239063处理，检测增殖和C/EBPβ、PPARγ表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Biowest | -- |
| 胎牛血清 | Biowest | -- | |
| 细胞增殖检测 | BrdU细胞增殖ELISA试剂盒 | Roche Diagnostics | -- |
| Western blot | 抗磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 |
| p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| PPARγ抗体 | Cell Signaling Technology | 95128 | |
| C/EBPβ抗体 | Cell Signaling Technology | 3082 | |
| FABP4抗体 | Cell Signaling Technology | 2120 | |
| 抗兔IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗小鼠IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗NPBWR1抗体 | Bioss Antibodies | bs-8618R | |
| 抗NPBWR2抗体 | St John's Laboratory Ltd. | STJ192639 | |
| 抗NPB抗体 | Lifespan Biosciences | LS-C150319 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A1978 | |
| 细胞分离 | II型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | 青霉素 | -- | -- |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 台盼蓝 | -- | -- | |
| 分化诱导 | 胰岛素 | -- | -- |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| p38抑制 | SB239063 | -- | -- |
| RNA提取 | Extrazol试剂 | DNA-Gdańsk | -- |
| RT-qPCR | FIREScript RT cDNA合成混合物 | Solis BioDyne | -- |
| HOT FIREPol EvaGreen qPCR混合液Plus | Solis BioDyne | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | BCA蛋白检测试剂盒 | ThermoScientific | -- |
| Immun-Blot PVDF膜 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Pierce Power Blot卡盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Immobilon Forte Western HRP底物 | Merck Millipore | -- | |
| ChemiDoc Touch凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 脂质染色 | 油红O | -- | -- |
| 显微镜检查 | LSM 510倒置显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| Axio vision v. 4.6软件 | -- | -- | |
| RNA质量检测 | NanoDrop 1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | QuantStudio 12 K Flex实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 数据采集 | Synergy 2多功能酶标仪 | BioTek | -- |
| 数据分析 | Image Lab 6.1软件 | Bio-Rad Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 猪前脂肪细胞来源：背部皮下脂肪组织；消化酶：II型胶原酶（3 mg/mL）；消化时间：60分钟；离心条件：450×g，10分钟；培养基：DMEM-F12含10% FBS；细胞活力>95% 阅读提示：见Materials and Methods 4.2 Cell Isolation and Culture |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度：4×10^3细胞/孔（96孔板）；NPB浓度：1、10、100 nmol/L；处理时间：24和48小时；BrdU标记时间：4小时；固定时间：30分钟；抗体孵育：70分钟；底物孵育：20分钟；终止液：1M H2SO4 25 μL；检测波长：450 nm 阅读提示：见Materials and Methods 4.3 Cell Proliferation Assay |
| 分化诱导 | 分化培养基成分：850 nM胰岛素、10 nM地塞米松、2 nM三碘甲状腺原氨酸；NPB浓度：10-100 nmol/L；分化时间：1天和6天；培养基每两天更换 阅读提示：见Materials and Methods 4.4 Differentiation of White Preadipocytes |
| 脂质积累检测 | 固定：10%福尔马林，10分钟和1小时；ORO染色：10分钟；定量时使用100%异丙醇洗脱；检测波长：520 nm 阅读提示：见Materials and Methods 4.5 Oil Red O (ORO) Staining and Microphotographs |
| 基因表达检测 | RNA提取：Extrazol试剂；cDNA合成：FIREScript RT Mix，1 μg总RNA；qPCR：HOT FIREPol EvaGreen Mix；内参基因：HPRT；相对定量方法：2^-ΔΔCt 阅读提示：见Materials and Methods 4.6 Reverse Transcription and Real-Time qPCR |
| 蛋白表达检测 | 蛋白提取：RIPA缓冲液加蛋白酶和磷酸酶抑制剂；蛋白上样量：30 μg；凝胶：5-12/18% Tris-HCl SDS-PAGE；一抗稀释：1:1000；二抗稀释：1:5000；内参：β-actin 阅读提示：见Materials and Methods 4.7 Western Blot Immunodetection |