CXCR1 and its downstream NF-κB inflammation signaling pathway as a key target of Guanxinning injection for myocardial ischemia/reperfusion injury.
包含小鼠I/R模型、体外OGD/R细胞模型、RNA-seq、分子对接、CETSA、Western blot、免疫组化等多层级验证，并进行了功能验证和机制验证。
小鼠心肌缺血/再灌注（I/R）模型（C57BL/6J小鼠） 小鼠HL-1心肌细胞系 人AC-16心肌细胞系 HL-1细胞OGD/R损伤模型
小鼠I/R模型中，GXNI给药剂量（1、3、9 mL/kg）及阳性药美托洛尔（10 mg/kg）经尾静脉注射，于心肌缺血后10分钟内给药 小鼠心肌缺血30 min，再灌注24 hrs，通过TTC染色、H&E染色及血清生化指标（LDH、AST、CK、CK-MB、cTNT）评估心肌损伤 HL-1细胞OGD/R模型中，DSS浓度（0.3、1、3 μM）及GXNI（1 μL/mL）处理，OGD 150 min后复氧24 hrs CETSA实验：GXNI（5 μL/mL）和DSS（20 μM）与细胞裂解液孵育30 min，加热温度梯度（37-73℃） IL-8激活实验：重组人IL-8（100 nM）处理细胞，DSS（1 μM）或GXNI（1 μL/mL）干预
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估GXNI对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心脏功能和心肌损伤的保护作用。
对C57BL/6J小鼠结扎左前降支冠脉30 min后再灌注24 hrs建立MIRI模型，经尾静脉注射不同剂量GXNI（1、3、9 mL/kg）或阳性药美托洛尔（10 mg/kg）。采用超声心动图检测心功能，TTC染色和H&E染色评估心肌梗死面积和组织病理变化，并检测血清生化指标（LDH、AST、CK、CK-MB、cTNT）。
筛选GXNI改善MIRI的关键靶基因及信号通路。
对sham、I/R和GXNI（9 mL/kg）处理的小鼠心脏组织进行转录组测序，分析差异表达基因（DEGs），并利用IPA软件进行通路富集分析。
验证RNA-seq发现的GXNI调节CXCR1-NF-κB-COX-2/ICAM-1/VCAM-1通路。
使用RT-PCR检测Cxcr1、Cxcr2、Traf6、Mapk10、Rhov和Cox2的mRNA表达；Western blot检测CXCR1、NF-κB、COX-2、ICAM-1和VCAM-1的蛋白水平；免疫组化检测心肌组织CXCR1的表达位置和水平。
预测GXNI中与CXCR1结合的主要活性成分。
使用Discovery Studio软件对GXNI成分进行分子对接，计算与CXCR1的结合能量，筛选出得分最高的成分。
验证GXNI及丹参素（DSS）是否直接与CXCR1蛋白结合。
使用CETSA实验检测GXNI和DSS处理对CXCR1热稳定性的影响，并通过等温剂量反应曲线（ITDRFCETSA）评估结合剂量依赖性。
验证DSS对心肌细胞损伤的保护作用及对CXCR1表达的抑制。
将HL-1细胞进行氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）处理，然后给予不同浓度DSS（0.3、1、3 μM）或GXNI（1 μL/mL）处理，通过CCK-8检测细胞活力，免疫荧光检测细胞数量及CXCR1表达。
验证DSS通过抑制CXCR1-NF-κB-COX-2/ICAM-1/VCAM-1通路发挥保护作用。
在HL-1细胞OGD/R模型中，通过免疫荧光检测NF-κB、COX-2、ICAM-1和VCAM-1的表达，并与CXCR1抑制剂Reparixin进行对比。
评估GXNI和DSS对I/R或OGD/R诱导的炎症反应的抑制作用。
在体内小鼠模型中，通过免疫荧光染色检测心肌组织中性粒细胞浸润，ELISA检测心肌组织和血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平；在体外细胞模型中，检测细胞裂解液中炎症因子水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 冠心宁注射液 | China Shineway Pharmaceutical Group Ltd. | Z13020779 |
| 酒石酸美托洛尔 | -- | YZ-100084 | |
| TTC染色 | 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | Solarbio | G3005 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
| 蛋白提取 | 高效RIPA组织/细胞裂解液 | Solarbio | R0010 |
| Western blot | Tris缓冲盐水-Tween | Solarbio | T1081 |
| Tris-甘氨酸电泳缓冲液 | Solarbio | T1070 | |
| Western印迹转膜缓冲液 | Solarbio | D1060 | |
| Pierce™ ECL Western印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | 32109 | |
| SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | Beyotime Biotechnology | P0015L | |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）印迹膜 | GE Healthcare Life Science | -- | |
| 抗CXCR1抗体 | Bioss | bs-1009R | |
| 抗VCAM-1抗体 | Bioss | bs-0396R | |
| 抗COX2抗体 | Cell Signaling Technology | 12282S | |
| 抗NF-κB抗体 | Affinity Biosciences | AF5006 | |
| 抗ICAM-1抗体 | Affinity Biosciences | AF6088 | |
| 抗GAPDH抗体 | Immunoway | YM3215 | |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | Immunoway | RS0002 | |
| RT-qPCR | Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | 04897030001 |
| Bestar™ qPCR预混液 | DBI Bioscience | DBI-2043 | |
| ELISA | 小鼠cTNT ELISA试剂盒 | ZCIBIO Technology Co., Ltd | ZC-38814 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | ZCIBIO Technology Co., Ltd | ZC-37988 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | ZCIBIO Technology Co., Ltd | ZC-37974 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | ZCIBIO Technology Co., Ltd | ZC-39024 | |
| 生化指标检测 | 肌酸激酶检测试剂盒 | WANTAI DRD Co., Ltd | XM0140 |
| 肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒 | WANTAI DRD Co., Ltd | XM0240 | |
| 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | WANTAI DRD Co., Ltd | XM0340 | |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | WANTAI DRD Co., Ltd | GM0240 | |
| 药物处理 | 瑞帕利辛 | MedChemExpress | HY-15251 |
| 心肌梗死面积检测 | TTC溶液 | -- | -- |
| RNA-seq | TRIzol™试剂 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | -- | -- |
| Alexa Fluor 488荧光二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| DAPI核酸染色液 | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| 细胞活性检测 | CCK-8溶液 | -- | -- |
| 动物麻醉 | 2,2,2-三溴乙醇 | Sigma | T48402 |
| 心脏超声 | Vevo 2100 | VisualSonics | -- |
| 生化分析 | TBA-40F | Toshiba | -- |
| RT-qPCR | LightCycler®480 | Roche | -- |
| 组织脱水 | Excelsior | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 组织切片 | HM355S | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 染色 | Gemini | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 病理成像 | Vectra 3 | PerkinElmer | -- |
| 高内涵分析 | Operetta | PerkinElmer | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立与给药 | 小鼠品系（C57BL/6J，雄性，8-10周）、I/R手术细节（缺血30min，再灌注24hrs）、GXNI剂量（1、3、9mL/kg）、给药途径（尾静脉）、给药时间（缺血后10min内）、阳性药美托洛尔剂量（10mg/kg） 阅读提示：Materials and methods: 'Experimental animals', 'Mouse model of MIRI and drug administration' |
| 心脏功能与心肌损伤评估 | 超声心动图参数（LVEF, LVFS等）、TTC染色步骤（2% TTC、37℃ 10min）、血清生化指标（LDH, AST, CK, CK-MB, cTNT）检测方法 阅读提示：Materials and methods: 'Echocardiographic measurement', 'Quantification of myocardial infarction size', 'Measurement of biochemical parameters' |
| 转录组测序与通路分析 | 分组（sham, I/R, GXNI 9mL/kg）、每组样本量（n=3）、差异基因筛选标准（fold change≥1.5，P≤0.01）、IPA核心分析参数 阅读提示：Materials and methods: 'RNA sequencing', 'Ingenuity® pathway analysis' |
| 分子表达验证 | RT-PCR引物序列、Western blot抗体信息（anti-CXCR1等）、免疫组化一抗稀释度（1:100） 阅读提示：Materials and methods: 'Real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay', 'Western blotting', 'Immunohistochemistry' |
| CETSA与ITDRF | 药物处理浓度（GXNI 5 μL/mL, DSS 20 μM）、孵育时间（30min）、温度梯度（37-73℃）、加热时间（3min）、离心条件（20000 g, 20min） 阅读提示：Materials and methods: 'Cellular thermal shift assay', 'Isothermal dose-response' |
| 细胞OGD/R模型与药物处理 | 细胞系（HL-1）、OGD条件（无糖培养基，95% N2/5% CO2，150min）、复氧条件（完全培养基，24hrs）、DSS浓度（0.3,1,3μM）、GXNI浓度（1μL/mL）、Reparixin浓度（100nM） 阅读提示：Materials and methods: 'Cell culture', 'Establishment of OGD/R model and drug administration' |
| 炎症因子与中性粒细胞检测 | ELISA试剂盒（IL-1β, IL-6, TNF-α）、免疫荧光染色一抗（myeloperoxidase polyclonal antibody, 1:100）、荧光二抗（Alexa Fluor 488, 1:200）、DAPI 1:150 阅读提示：Materials and methods: 'Immunohistofluorescence', 'Statistical analysis' |
