细胞培养与处理
建立高糖和LPS联合处理MDBK细胞的体外模型，观察对细胞活力的影响。
MDBK细胞培养在含不同浓度葡萄糖（5.5 mM或25.5 mM）和不同浓度LPS（0、1、2、5 μg/mL）的培养基中处理24小时。
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高糖和脂多糖联合通过Notch3/mTOR信号通路诱导牛肾上皮细胞自噬
The combination of high glucose and LPS induces autophagy in bovine kidney epithelial cells via the Notch3/mTOR signaling pathway.
实验完整度
中研究包含体外细胞实验（MDBK细胞）和多种检测技术（Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、TEM），并进行了机制验证（Notch3抑制剂），但缺乏动物模型和患者样本，因此实验完整度评为中。
主要模型
MDBK牛肾细胞
重点核对
细胞处理：5.5 mM或25.5 mM葡萄糖与0、1、2、5 μg/mL LPS共处理24小时 自噬检测：Western blot检测LC3-II/I、Beclin1、p62蛋白水平 Notch3/mTOR通路验证：Western blot检测Notch3、p-mTOR蛋白水平 抑制剂处理：10 μM DAPT预处理6小时，再刺激24小时
摘要
背景：除呼吸道疾病外，肉牛在运输后也可能患有严重的肾脏疾病。高血糖和革兰氏阴性菌感染可能是牛在运输应激期间易患严重肾脏疾病的主要原因，然而，其确切机制仍不清楚。本研究旨在探讨高糖（HG）和脂多糖（LPS）联合处理是否能诱导牛肾细胞（MDBK）损伤和自噬，并探讨其潜在的分子机制。结果：我们发现，HG和LPS联合作用降低了MDBK细胞的活力。此外，HG和LPS联合处理也诱导了MDBK细胞自噬，其特征是LC3-II/I和Beclin1表达增加，p62表达降低。HG和LPS联合处理也显著增加了LC3荧光信号的形成。此外，我们检测了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和Notch3信号通路是否参与了HG和LPS诱导的自噬。结果表明，HG和LPS联合显著增加了Notch3蛋白表达，降低了p-mTOR蛋白表达，表明Notch3和mTOR信号通路被激活。然而，与Notch3抑制剂（DAPT）共处理可以逆转自噬的诱导，并增加p-mTOR的蛋白表达。结论：本研究表明，HG和LPS联合作用可诱导MDBK细胞自噬，且Notch3/mTOR信号通路参与了HG和LPS诱导的自噬。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高糖和LPS联合处理能否诱导牛肾细胞损伤和自噬，以及其潜在的分子机制是什么？
- 核心机制
- 高糖和LPS联合通过Notch3介导的mTOR信号通路诱导自噬。
- 主要证据
- 高糖和LPS联合处理降低MDBK细胞活力，增加LC3-II/I和Beclin1表达、降低p62表达；同时增加Notch3表达、降低p-mTOR表达；使用Notch3抑制剂DAPT可逆转自噬和mTOR磷酸化降低。
- 研究意义
- 研究为高糖和LPS联合引起的肾病发病机制提供理论基础，有助于开发解决牛高血糖状态下细菌感染相关肾毒性的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
自噬检测
评估高糖和LPS联合处理是否诱导MDBK细胞自噬。
通过Western blot和qRT-PCR检测自噬相关蛋白（LC3-II/I、Beclin1、p62）的表达，并通过免疫荧光检测LC3荧光信号。
信号通路分析
探讨Notch3和mTOR信号通路在高糖和LPS诱导的自噬中的作用。
通过Western blot和qRT-PCR检测Notch3、mTOR、p-mTOR的表达。
机制验证
验证Notch3是否通过mTOR信号通路介导高糖和LPS诱导的自噬。
使用Notch3抑制剂DAPT预处理细胞，检测自噬相关蛋白和mTOR磷酸化水平的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12(HAM)培养基 | Biological Industries | -- |
| 低糖DMEM培养基 | Biological Industries | -- | |
| 高糖DMEM培养基 | Biological Industries | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Solarbio | -- |
| DAPT | Selleck | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| qRT-PCR | SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Notch3抗体 | affinity | -- | |
| mTOR抗体 | Bioss | bs-1992R | |
| p-mTOR抗体 | Affinity | AF3308 | |
| LC3A抗体 | Novus Biologicals | NB100-2331 | |
| p62抗体 | GeneTex | GTX100685 | |
| Beclin1抗体 | CST | 3495T | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Solarbio | SE134 | |
| ECL化学发光检测系统 | Tanon-5200 | -- | |
| 免疫荧光 | TritonX-100 | Servicebio | -- |
| 牛血清白蛋白 | Servicebio | -- | |
| CY3荧光染料 | Servicebio | GB21303 | |
| DAPI染色液 | Servicebio | -- | |
| 免疫荧光观察 | 尼康ECLIPSE C1显微镜 | NIKON | -- |
| 透射电镜 | Epon环氧树脂 | Chengdu Rongshengke Biotechnology Co., Ltd | -- |
| 0.1%柠檬酸铅 | Chengdu Rongshengke Biotechnology Co., Ltd | -- | |
| 10%醋酸铀 | Chengdu Rongshengke Biotechnology Co., Ltd | -- | |
| 透射电镜观察 | JEM-1400PLUS透射电子显微镜 | JEOL | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | MDBK细胞来源、培养基类型、葡萄糖浓度（5.5 mM和25.5 mM）、LPS浓度（0、1、2、5 μg/mL）、处理时间（24小时） 阅读提示：详见Materials and methods中的Cell culture部分 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度（2×10^5 cells）、处理时间（24小时）、CCK-8试剂盒操作 阅读提示：详见Materials and methods中的CCK-8 assay部分 |
| 自噬检测 | Western blot检测的蛋白（LC3-II/I、Beclin1、p62）、qRT-PCR检测的基因（LC3B、Beclin1、p62）、免疫荧光检测的LC3荧光 阅读提示：详见Materials and methods中的Western blot、qRT-PCR和Immunofluorescence部分 |
| 信号通路验证 | Notch3、mTOR、p-mTOR蛋白和mRNA表达 阅读提示：详见Materials and methods中的Western blot和qRT-PCR部分 |
| 机制验证 | DAPT浓度（10 μM）、预处理时间（6小时）、HG和LPS刺激浓度（25.5 mM葡萄糖和5 μg/mL LPS）、处理时间（24小时） 阅读提示：详见Figure 4 legend及Materials and methods中的Cell culture部分 |