克隆与序列分析血清素能标志物
鉴定尼罗罗非鱼中血清素能标志物基因并进行进化保守性分析。
从尼罗罗非鱼基因组获取预测序列，设计引物，PCR扩增ORF，进行多序列比对和系统发育分析。
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血清素系统部分参与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）免疫细胞的免疫调节
Serotonin system is partially involved in immunomodulation of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) immune cells.
实验完整度
高包含基因克隆和序列分析、组织表达分布、细菌感染后表达变化、scRNA-seq与RNA-seq分析、体外5-HT及受体拮抗剂功能实验等多层级验证。
主要模型
尼罗罗非鱼 头肾白细胞（HKL） 无乳链球菌感染模型
重点核对
鱼体重100±10g，水温28±0.5℃ S. agalactiae ZQ0910腹腔注射浓度108 CFU/mL，100 μL/鱼 HKL分离使用34%/51% percoll梯度离心 5-HT处理浓度0、10 nM、10 μM BMY7378处理浓度10 μM
摘要
血清素（5-羟色胺）是一种众所周知的神经递质，影响情绪、行为和认知。此外，在哺乳动物中已发现血清素的多种免疫调节功能。然而，血清素系统在鱼类免疫中的调节作用仍不清楚。本研究鉴定并表征了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中的多种血清素能标志物。研究了细菌感染期间血清素系统的参与。此外，还评估了尼罗罗非鱼免疫细胞内血清素能标志物的表达特征和具体功能。总体而言，克隆并表征了尼罗罗非鱼中22个进化上保守的血清素能标志基因。这些分子的转录水平在大脑中最为丰富，并且在无乳链球菌感染期间其转录本被诱导。然而，尼罗罗非鱼免疫细胞上存在的血清素能标志物很少，并且在免疫反应期间未观察到明显的免疫调节作用。本研究为进一步研究鱼类的免疫机制以及动物中血清素系统的进化奠定了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 血清素系统在鱼类免疫中的调节作用及其在免疫细胞上的表达特征尚不清楚，本研究旨在探究尼罗罗非鱼血清素系统是否参与免疫调节。
- 核心机制
- 尼罗罗非鱼免疫细胞上血清素能标志物表达极少，5-HT对免疫反应的调节作用微弱，主要影响IL-10、MMP2、CD86的上调和CREB、CD209的下调，部分效应可被HTR拮抗剂BMY7378逆转。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和RNA-seq分析发现22个血清素能标志物在HKL中几乎不表达，HTR6除外；qRT-PCR显示5-HT仅对少数免疫相关基因有显著影响，且HTR拮抗剂BMY7378可改变部分效应。
- 研究意义
- 本研究为深入研究鱼类神经免疫学以及血清素系统在鱼类中的进化提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织分布表达分析
检测血清素能标志物在健康尼罗罗非鱼不同组织中的mRNA和蛋白表达水平及定位。
提取脑、鳃、头肾、肠、肝、肌、皮肤、脾的RNA，qRT-PCR检测表达；Western blot检测HTR1A和TPH2蛋白；IF检测脑内5-HT和HTR1A定位。
细菌感染后表达变化分析
探究S. agalactiae感染对血清素能标志物转录水平的影响。
对尼罗罗非鱼腹腔注射S. agalactiae，在不同时间点收集组织，提取RNA，qRT-PCR检测表达变化。
单细胞转录组分析免疫细胞中血清素能标志物表达
评估HKL各免疫细胞亚群中血清素能标志物的表达特征。
对已有scRNA-seq数据重新分析，调整过滤参数，聚类识别免疫细胞亚群，分析标志物表达。
RNA-seq验证血清素能标志物表达
通过bulk RNA-seq验证HKL中血清素能标志物的整体表达水平。
提取HKL总RNA，构建文库，Illumina HiSeq2500测序，参考基因组比对和从头组装，计算FPKM。
5-HT功能及HTR拮抗剂实验
评估5-HT及其受体拮抗剂对HKL免疫反应的影响。
用LPS和LTA模拟细菌感染，加入不同浓度5-HT或/和BMY7378，通过qRT-PCR检测18个免疫相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNAiso Plus | TaKaRa | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | -- |
| PCR扩增 | Premix Taq™热启动版本 | TaKaRa | -- |
| qRT-PCR | TB Green® Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus） | TaKaRa | -- |
| QuantStudio 6和7 Flex实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NanoDrop测量 | NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白提取 | 蛋白提取试剂盒 | Solarbio | BC3710 |
| Western blot | PVDF膜 | Merck | IPVH00010 |
| QuickBlock™ Western Blot封闭液 | Beyotime | -- | |
| 抗HTR1A抗体 | Elabscience | E-AB-12217 | |
| 抗TPH2抗体 | Bioss | bs-8729R | |
| QuickBlock™ Western Blot一抗稀释液 | Beyotime | -- | |
| 抗GAPDH抗体（HRP偶联） | BOSTER | BM3896 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Beyotime | A0208 | |
| 增强化学发光法 | Beyotime | P0018S | |
| 组织固定与包埋 | Dietrich固定液 | -- | -- |
| 显微镜观察 | ZEISS Axioscope 5显微镜 | Zeiss | -- |
| 免疫荧光 | EDTA抗原修复液 | Beyotime | P0085 |
| QuickBlock™免疫染色封闭液 | Beyotime | -- | |
| 酪胺信号放大试剂盒（Y6085L） | UElandy | Y6085L | |
| 抗血清素抗体 | Sigma | S5545 | |
| 酪胺信号放大试剂盒（Y6088L） | UElandy | Y6088L | |
| HKL分离 | 40 μm不锈钢尼龙网 | Greiner Bio-One | -- |
| HKL培养 | Leibovitz's L-15培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HKL分离 | Percoll分离液 | Solarbio | -- |
| RNA-seq文库构建 | Oligo-dT磁珠 | Qiagen | -- |
| RNA测序 | Illumina HiSeq2500 | Illumina | -- |
| 细胞刺激实验 | 脂多糖（LPS） | Beyotime | -- |
| 脂磷壁酸（LTA） | Shanghai Yuan Ye Bio | -- | |
| 细胞处理 | 血清素（5-羟色胺） | Solarbio | IH0350 |
| 受体拮抗剂实验 | BMY7378 | Beyotime | SD9540 |
| 麻醉 | MS-222 | Sigma | -- |
| 5'RACE | SMARTer RACE 5'/3'试剂盒 | Clontech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 鱼体饲养 | 体重100±10 g；水温28±0.5℃；pH 7.3–7.8；溶解氧5.0–6.0 mg/L；投喂量3%体重。 阅读提示：Materials and methods, Fish rearing |
| 细菌感染 | S. agalactiae ZQ0910腹腔注射，108 CFU/mL，100 μL/鱼；时间点0、6、12、24、48 h。 阅读提示：Materials and methods, Pathogenic bacteria and challenge |
| HKL制备 | 使用34%/51% percoll梯度离心，400 g 40 min；白细胞层收集。 阅读提示：Materials and methods, Nile tilapia head kidney leukocyte (HKL) preparation |
| scRNA-seq分析 | UMI上限值调整至15000；样本为Control (PBS)和Treated (Poly I:C)各混合5条鱼的HKL。 阅读提示：Materials and methods, Nile tilapia HKL single-cell RNA-seq sequencing and cell clustering |
| 5-HT功能实验 | LPS和LTA浓度5 μg/mL；5-HT浓度0、10 nM、10 μM；时间点0、10、30 min、3、6 h。 阅读提示：Materials and methods, 5-HT function on Nile tilapia HKL response to stimulation assay |
| HTR拮抗剂实验 | BMY7378浓度10 μM；分组：对照、LPS刺激、LTA刺激，每孔加入5-HT或/和BMY7378。 阅读提示：Materials and methods, HTRs involvement and function on Nile tilapia HKL response to stimulation assay |