miR-30d表达分析
检测miR-30d在感染仔猪回肠组织和CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中的表达变化。
从C型产气荚膜梭菌感染腹泻仔猪和正常仔猪回肠组织及不同时间点（12、24、36、48小时）CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中提取RNA，通过qPCR检测miR-30d水平。
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miR-30d抑制保护IPEC-J2细胞免受产气荚膜梭菌β2毒素诱导的炎症损伤
miR-30d Inhibition Protects IPEC-J2 Cells Against Clostridium perfringens Beta2 Toxin-Induced Inflammatory Injury.
实验完整度
高包含细胞模型（IPEC-J2，HEK-293T）、动物模型（仔猪感染模型）、患者样本（猪回肠组织）等多层级，以及功能获得/丧失、双荧光素酶报告基因、qPCR、Western blot等验证。
主要模型
IPEC-J2细胞 HEK-293T细胞 C型产气荚膜梭菌感染仔猪模型
重点核对
CPB2毒素浓度20 μg/ml，处理时间36小时 miR-30d模拟物50nM、抑制剂150nM，转染后36小时 PSME3过表达载体1μg，si-PSME3 150nM 双荧光素酶报告基因验证miR-30d与PSME3 3'UTR结合 qPCR检测miR-30d、PSME3、CDK4、PCNA、p21表达
摘要
产气荚膜梭菌β2（CPB2）毒素是产气荚膜梭菌（C. perfringens）的毒力因子之一，可引起仔猪坏死性肠炎。越来越多的证据表明microRNAs（miRNAs）参与炎症过程的调控。此前，我们发现miR-30d在正常仔猪回肠和C型产气荚膜梭菌感染腹泻仔猪回肠中差异表达。本研究发现，在不同时间点，CPB2毒素处理的猪肠上皮细胞（IPEC-J2）中miR-30d表达降低。随后，我们确定miR-30d抑制剂减弱了CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞炎症损伤，并促进细胞增殖和细胞周期进程，而miR-30d模拟物具有相反的结果。此外，我们通过双荧光素酶报告基因实验、qPCR和Western blot证实了蛋白酶体激活剂亚基3（PSME3）是miR-30d的下游靶基因。我们还发现PSME3的过表达抑制了CPB2毒素诱导的炎症损伤，并促进了细胞增殖和周期进程。我们的结果表明，miR-30d通过靶向PSME3加重CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞炎症损伤，从而为仔猪腹泻的预防和治疗在分子水平上提供了新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-30d在CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞炎症损伤中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- miR-30d通过靶向PSME3的3'UTR负调控其表达，从而加重CPB2毒素诱导的炎症反应并抑制细胞增殖和周期进程。
- 主要证据
- 体内回肠组织qPCR显示miR-30d下调；体外IPEC-J2细胞中miR-30d抑制剂降低IL-1β、IL-6、IL-8水平、LDH活性、ROS水平，并促进增殖；miR-30d模拟物增加炎症；双荧光素酶报告基因证实miR-30d靶向PSME3；PSME3过表达逆转miR-30d模拟物的促炎效应。
- 研究意义
- 研究为仔猪腹泻的预防和治疗提供了新的分子靶点，并为培育抗产气荚膜梭菌性腹泻猪的进一步研究奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miR-30d功能验证
评估miR-30d对CPB2毒素诱导的炎症损伤和细胞增殖的影响。
在IPEC-J2细胞中转染miR-30d模拟物或抑制剂，然后使用CPB2毒素处理，检测炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8）水平、LDH活性、ROS水平、细胞活力（CCK-8）、增殖（EdU）和细胞周期（流式）。
靶基因预测与验证
确认PSME3是miR-30d的直接靶基因。
利用TargetScan预测结合位点；构建PSME3 3'UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体，与miR-30d模拟物共转染HEK-293T细胞，检测荧光素酶活性；在IPEC-J2细胞中检测PSME3 mRNA和蛋白水平。
PSME3功能验证
评估PSME3对CPB2毒素诱导的炎症和增殖的影响。
在IPEC-J2细胞中过表达或敲低PSME3，然后CPB2毒素处理，检测炎症因子、LDH、ROS、细胞活力、增殖和细胞周期。
救援实验
验证miR-30d通过靶向PSME3发挥促炎作用。
在IPEC-J2细胞中共转染miR-30d模拟物和pc-PSME3载体或对照，然后CPB2毒素处理，检测炎症和增殖指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | HyClone | -- |
| DMEM培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | Everygreen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| pcDNA3.1(+)载体 | Promega | -- | |
| PSME3过表达载体 | GENEWIZ | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | mlbio | -- |
| LDH检测 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | APPLYGEN | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | Beyotime | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Solarbio | -- |
| EdU检测 | EdU-555细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞周期检测 | 核糖核酸酶A | Solarbio | -- |
| 碘化丙啶染色液 | Servicebio | -- | |
| qPCR | Trizol试剂 | TransGen Biotech | -- |
| miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biotech | -- | |
| 2×SYBR Green qPCR预混液 | Servicebio | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 抗PSME3抗体 | Bioss | bs-4222R | |
| 抗β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| 山羊抗兔HRP IgG抗体 | Bioss | bs-0295G-HRP | |
| 增强化学发光试剂盒 | NCM Biotech | -- | |
| 载体构建 | pmirGLO载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 显微镜观察 | 荧光显微镜（Olympus IX71） | Olympus | IX71 |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 统计分析 | SPSS 18.0软件 | IBM Corp. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | IPEC-J2和HEK-293T细胞培养基、FBS浓度、培养温度、CO2浓度 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture and Establishment of CPB2 Toxin Injury IPEC-J2 Cells Model |
| CPB2毒素处理 | CPB2毒素浓度20 μg/ml，处理时间36小时 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture and Establishment of CPB2 Toxin Injury IPEC-J2 Cells Model |
| 细胞转染 | miR-30d mimic浓度50nM，inhibitor浓度150nM，pcDNA3.1/PSME3过表达载体1μg，si-PSME3浓度150nM，转染试剂Lipofectamine 2000 阅读提示：Materials and Methods: Cell Transfection |
| 炎症因子检测 | ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-8，细胞培养上清收集方法 阅读提示：Materials and Methods: Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay |
| LDH和ROS检测 | LDH试剂盒、DCFH-DA探针稀释比例(1:1000)、孵育时间(20分钟)、激发/发射波长(488/535 nm) 阅读提示：Materials and Methods: Detection of Lactate Dehydrogenase Activity and Reactive Oxygen Species Level |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂加入量(10 μL)、孵育时间(2小时)、检测波长450nm 阅读提示：Materials and Methods: Detection of Cell Viability |
| 增殖检测 | EdU试剂盒、EdU孵育时间(2小时) 、细胞荧光显微镜观察 阅读提示：Materials and Methods: 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Staining |
| 细胞周期检测 | 乙醇固定浓度75%、RNase A处理浓度(10 mg/ml)、PI染色浓度(100 μg/ml)、流式细胞仪型号 阅读提示：Materials and Methods: Flow Cytometry for Cell Cycle |
| qPCR | RNA提取试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green预混液、内参(U6和GAPDH)、2^-ΔΔCt法 阅读提示：Materials and Methods: Real-Time Quantitative PCR Analysis |
| Western blot | RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、抗体稀释比例(PSME3 1:800, β-actin 1:1000, HRP二抗1:1000)、ECL显影 阅读提示：Materials and Methods: Western Blot |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO载体、共转染比例、检测时间(48小时) 阅读提示：Materials and Methods: Plasmid Construction and Dual Luciferase Reporter Assay |