重组病毒构建与鉴定
构建缺失gE/gI/TK基因并共表达NADC30样PRRSV GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒，并验证其基因组成和蛋白表达。
利用CRISPR/Cas9介导的同源重组将CMV-EGFP-T2A-ORF6-P2A-ORF5-SV40靶基因插入PRV XJ的gE/gI缺失位点，并删除TK基因。通过PCR鉴定基因缺失和外源基因插入；通过IFA和Western blot检测GP5、M、gE和gB蛋白表达。
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共表达NADC30样猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的重组伪狂犬病毒的构建及免疫原性分析
The Construction and Immunogenicity Analyses of Recombinant Pseudorabies Virus With NADC30-Like Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus-Like Particles Co-expression.
实验完整度
高包含体外细胞实验（病毒构建、蛋白表达、生长曲线、电镜观察）、小鼠安全性实验、免疫原性实验（抗体、细胞因子、T细胞亚群）和攻毒保护实验，多个独立证据层级且包含功能验证和机制验证。
主要模型
BHK-21细胞 HEK293T细胞 Marc-145细胞 BALB/c小鼠
重点核对
重组病毒rPRV-NC56的gE/gI/TK基因缺失及外源基因插入的PCR鉴定 GP5和M蛋白在BHK-21细胞中的表达（IFA和Western blot） 重组病毒在BHK-21细胞中的一步生长曲线和噬斑大小 小鼠免疫剂量：rPRV-NC56 10^6 TCID50，200 μl/剂，肌肉注射，初免后2周加强免疫 攻毒剂量：10×LD50的PRV XJ（LD50=10^2.74 TCID50/ml），足底注射
摘要
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）和伪狂犬病（PR）是高度传染性的猪病，在中国造成重大经济损失。呼吸系统和生殖系统是主要靶系统。先前研究表明，现有的PR病毒（PRV）和PRRS病毒（PRRSV）商业疫苗不能提供针对中国PRV变异株和NADC30样PRRSV株的完全保护。在本研究中，以PRV变异株XJ和NADC30样PRRSV株CHSCDJY-2019为亲本，构建了缺失gE/gI/TK基因并共表达NADC30样PRRSV GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒（rPRV）-NC56。rPRV-NC56在BHK-21细胞中稳定增殖，并能稳定表达GP5和M蛋白。由于引入了自切割2A肽，GP5和M蛋白能够独立表达并在rPRV-NC56感染的BHK-21细胞中形成PRRSV病毒样颗粒（VLPs）。rPRV-NC56对小鼠是安全的；它能在小鼠肺中长期定植并表达目标蛋白。用rPRV-NC56接种可诱导小鼠产生PRV和NADC30样PRRSV特异性体液和细胞免疫应答，并100%保护小鼠免受强毒PRV XJ株的攻击。此外，rPRV-NC56引发的病毒中和抗体（VNA）对SCNJ-2016（HP-PRRSV）的滴度显著低于对CHSCDJY-2019（NADC30样PRRSV）的滴度。因此，rPRV-NC56似乎是针对NADC30样PRRSV和PRV的有前景的候选疫苗，用于控制和根除变异PRV和NADC30样PRRSV。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旨在解决现有商业疫苗无法完全保护中国PRV变异株和NADC30样PRRSV株感染的问题，探索构建共表达NADC30样PRRSV GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒作为候选疫苗的可行性。
- 核心机制
- rPRV-NC56通过缺失gE/gI/TK基因减弱毒力，并利用自切割2A肽使NADC30样PRRSV GP5和M蛋白独立表达，组装成病毒样颗粒（VLPs），从而诱导针对PRV和NADC30样PRRSV的特异性体液和细胞免疫应答，实现对强毒PRV的完全保护。
- 主要证据
- 在BHK-21细胞中证实rPRV-NC56稳定表达GP5和M蛋白并形成VLPs；在小鼠中证实其安全性、在肺中长期定植和表达目标蛋白、诱导特异性抗体和VNA、T细胞增殖和细胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ）上调，并且攻毒实验显示100%保护小鼠免受PRV XJ攻击。
- 研究意义
- 作者提出rPRV-NC56可作为针对NADC30样PRRSV和PRV的有前景的候选疫苗，并可作为DIVA疫苗用于进一步控制和根除PRRSV，其在小鼠上的安全性及免疫原性评价为在动物上开展疫苗评价研究提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生物学特性分析
评估外源基因插入和基因缺失对重组病毒复制和噬斑形成能力的影响。
比较rPRV-NC56、rPRV XJ-ΔgE/gI/TK-EGFP和PRV-XJ在BHK-21细胞中的一步生长曲线和噬斑大小，并通过PCR验证连续传代21代后基因稳定性。
病毒样颗粒形成观察
验证rPRV-NC56感染的细胞中是否形成PRRSV病毒样颗粒。
通过透射电子显微镜观察rPRV-NC56、rPRV XJ-ΔgE/gI/TK-EGFP、PRV-XJ和CHSCDJY-2019感染Marc-145细胞中的病毒颗粒形态，并通过超滤浓缩和Western blot检测上清中GP5和M蛋白。
小鼠安全性评价
评估重组病毒rPRV-NC56对小鼠的安全性。
将不同剂量的rPRV-NC56、rPRV XJ-ΔgE/gI/TK-EGFP、PRV-XJ和DMEM接种BALB/c小鼠，监测14天，检测IL-6和TNF-α水平，并进行脑组织病理学检查。
肺组织定植和表达检测
检测rPRV-NC56在小鼠肺中的定植和目的蛋白的表达情况。
免疫小鼠后在不同时间点收集肺组织，通过IHC检测GP5蛋白表达，通过qPCR检测PRV gB基因拷贝数以评估病毒定植。
免疫原性评价
评估rPRV-NC56诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答的能力。
免疫小鼠后采集血清检测PRV gB、PRRSV GP5和M特异性抗体和中和抗体；分离脾细胞进行增殖实验和流式细胞术检测CD3+/CD4+/CD8+ T细胞亚群；检测血清中IL-2、IL-4、IFN-γ水平。
攻毒保护实验
评估rPRV-NC56免疫对小鼠抵抗强毒PRV XJ攻击的保护效果。
免疫后8周，小鼠通过足底注射10×LD50的PRV XJ进行攻毒，监测14天记录存活率，并在3 dpc检测IL-6和TNF-α，5 dpc进行组织病理学检查。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 12100046 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099133C | |
| 重组病毒构建 | 无缝克隆试剂盒 | Beyotime | D7010FT |
| EcoR I限制酶 | Takara | 1611 | |
| Bcl I限制酶 | Takara | 1045A | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000015 |
| DNA提取 | 基因组DNA纯化试剂盒 | Thermo | K182001 |
| 免疫荧光 | X-Triton | Sangon Biotech | 9002-93-1 |
| 兔抗GP5多克隆抗体 | Bioss | bs-4504R | |
| 兔抗M多克隆抗体 | Bioss | bs-4507R | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 20012050 | |
| 594标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-4 | |
| DAPI染色液 | Solarbio | C0060 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| SDS-PAGE凝胶电泳 | Bio-Rad Laboratories | 1610185 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad Laboratories | 1620117 | |
| 小鼠抗PRV gE单克隆抗体 | TianTech | 82289 | |
| 兔抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗 | Sangon Biotech | D110087 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗 | Sangon Biotech | D110058 | |
| SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo | 34580 | |
| 病毒样颗粒浓缩 | 100 kDa截留分子量超滤离心管 | Millipore | UFC9100 |
| 细胞因子检测 | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Thermo | KMC0061 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo | BMS607-3 | |
| qPCR标准品构建 | PMD-18T载体 | TAKARA | 6011 |
| 细胞因子检测 | 小鼠IL-2 ELISA试剂盒 | Thermo | BMS601 |
| 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | Thermo | BMS613 | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Thermo | BMS606-2 | |
| 抗体检测 | 抗gB抗体ELISA试剂盒 | IDEXX | -- |
| 流式细胞术 | PE-Cy标记抗小鼠CD8α抗体 | MULTI | 70-AM00804-100 |
| FITC标记抗小鼠CD4抗体 | MULTI | 70-AM00401-100 | |
| APC标记仓鼠抗小鼠CD3ε抗体 | MULTI | 70-AM003E07-100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组病毒构建 | 质粒浓度和比例：PRV-XJ基因组DNA 3 μg、pEGFP-2A-NC-OFR5-6质粒5 μg、sgRNA-gE质粒5 μg，摩尔比20:1；转染试剂Lipofectamine 3000 阅读提示：参见Materials and Methods中的Generation of Recombinant Virus and PCR Identification |
| 病毒生长曲线和噬斑 | 感染复数MOI=0.1；取样时间点0、4、8、12、24、36、48、64 hpi；噬斑实验使用100 TCID50，覆盖1%低熔点琼脂糖，培养96小时 阅读提示：参见Materials and Methods中的Virus One-Step Growth Curve and Plaque Assays |
| 病毒样颗粒观察 | 病毒接种剂量1/1000；Marc-145细胞；超滤浓缩使用100-KDa MWCO离心浓缩器 阅读提示：参见Materials and Methods中的Transmission Electron Microscopic Observation |
| 小鼠安全性实验 | 小鼠品系BALB/c，体重25 g，每组10只；rPRV-NC56剂量10^6.0、10^7.0、10^8.0 TCID50；接种途径肌肉注射，200 μl/剂；观察14天；检测IL-6和TNF-α的时间点为接种后1和3天 阅读提示：参见Materials and Methods中的Safety, Immunogenicity, and Challenge in Mice |
| 免疫和攻毒实验 | 免疫剂量10^6 TCID50，200 μl肌肉注射；初免后2周加强免疫；攻毒剂量10×LD50的PRV XJ（LD50=10^2.74 TCID50/ml），足底注射 阅读提示：参见Materials and Methods中的Safety, Immunogenicity, and Challenge in Mice |
| 中和抗体检测 | 血清56℃灭活30分钟；病毒200 TCID50；BHK-21或Marc-145细胞；孵育37℃ 1小时；培养5-7天观察CPE 阅读提示：参见Materials and Methods中的Neutralizing Antibody Assay |