鉴定Rac1在初级纤毛中的富集
确定Rac1是否定位于初级纤毛，并可能与Hh信号相关。
分离不同密度培养的MEFs获得去纤毛和纤毛化的细胞，通过LC-MS/MS和免疫荧光检测Rac1等蛋白的富集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Hedgehog信号传导受Rac1活性控制
Hedgehog signaling is controlled by Rac1 activity.
实验完整度
高包含细胞系和MEFs的体外分子机制实验、转基因小鼠体内表型分析及人MB组织样本验证，且包含功能获得和功能丧失实验，并验证了机制通路。
主要模型
C3H10T1/2细胞 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) 转基因小鼠(GFAP-Cre;SmoM2+/-和Prx1-Cre;Rac1f/f) 人髓母细胞瘤(MB)组织样本
重点核对
C3H10T1/2细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的培养条件（DMEM+10%FBS） N-Shh处理浓度100 ng/ml，与对照比较 Rac1抑制剂NSC23766浓度10 μg/ml Cyclopamine浓度5 μM GFAP-Cre;SmoM2+/-和Prx1-Cre;Rac1f/f小鼠品系
摘要
理由：转录因子Gli的核转位对Hedgehog(Hh)信号激活不可或缺，其失调导致癌症进展；然而，调控Gli核转位的机制尚不清楚。在此，我们报道Hh响应中的Gli转位需要Rac1激活。方法：使用C3H10T1/2细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞来探索Rac1活性调控Hh信号转导的分子机制。利用转基因小鼠品系和人髓母细胞瘤(MB)组织样本检测Rac1在Hh指导的肢芽发育和MB进展中的作用。结果：我们显示，当Hh与受体Patched1(Ptch1)结合后，受体Smoothened(Smo)从Ptch1解离并与Vav2结合，导致Vav2在Y172位点的磷酸化水平升高，进一步激活Rac1。Rac1的作用依赖于对KIF3A在S689和T694位点磷酸化水平的调控，进而影响IFT88稳定性，随后抑制SuFu-Gli复合物的形成，导致Gli从复合物中释放，并最终使Gli转位进入细胞核。此外，在GFAP-Cre;SmoM2+/-小鼠小脑和人Shh型MB组织中，Vav2 phospho-Y172水平上调，而小鼠胚胎肢芽外胚层中Rac1的缺失(Prx1-Cre;Rac1f/f)通过破坏Gli核转位阻碍了Hh激活。结论：总之，我们的结果揭示了Rac1激活及其后续的Gli转位是控制Hh信号的一种迄今未表征的机制，并可能为该信号通路的治疗干预提供靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Hh信号激活时，Gli核转位的调控机制尚不清楚，本研究旨在探讨Rac1在其中的作用。
- 核心机制
- Hh与受体Ptch1结合后，Smo与Ptch1解离并结合Vav2，导致Vav2 Y172磷酸化，激活Rac1；Rac1通过PAK1磷酸化KIF3A，进而稳定IFT88，抑制SuFu-Gli复合物形成，使Gli释放并转位入核。
- 主要证据
- 在C3H10T1/2细胞和MEFs中通过Gli-Luc报告基因、免疫沉淀、蛋白稳定性测定显示Rac1激活促进Gli核转位；在GFAP-Cre;SmoM2+/-小鼠和人Shh型MB组织中观察到Vav2磷酸化水平升高；在Prx1-Cre;Rac1f/f小鼠胚胎中Rac1缺失阻碍Hh激活。
- 研究意义
- 研究揭示了Hh-Vav2-Rac1-PAK1通路在Hh信号调控中的关键作用，可能为Hh激活的癌细胞提供额外的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Rac1对Hh信号的作用
检测Rac1激活或抑制对Hh信号活性的影响。
在C3H10T1/2细胞中转染Gli-Luc报告基因和Rac1突变体，或使用NSC23766处理，检测荧光素酶活性。
确定Rac1的作用位点（SuFu）
检验Rac1是否通过SuFu影响Hh信号。
在Ptch1或SuFu敲除细胞中检测Rac1抑制对Gli-Luc活性的影响，并通过免疫共沉淀检测SuFu-Gli复合物形成。
研究Hh对Rac1活性的影响及PAK1介导作用
探究Hh信号是否激活Rac1，以及PAK1是否参与Rac1介导的Hh信号。
通过Rac1 pull-down实验检测GTP-Rac1水平，用SAG或caSmo激活Hh，用Cyclopamine抑制Hh，检测pPAK1水平，并使用IPA-3抑制PAK1。
鉴定Smo与Vav2的相互作用
阐明Smo如何激活Rac1。
通过免疫沉淀和免疫荧光检测Smo与Vav2的结合及Vav2 Y172磷酸化水平。
验证Rac1对IFT88稳定性的调控
确定Rac1是否通过影响IFT88稳定性调控Hh信号。
使用CHX追踪实验和MG132处理，检测Rac1激活或抑制对IFT88半衰期的影响，并检测IFT88敲低对Gli-Luc活性的影响。
验证KIF3A磷酸化介导Rac1的信号
阐明Rac1如何通过KIF3A磷酸化稳定IFT88。
通过免疫沉淀检测KIF3A与IFT88的结合，通过体外激酶实验检测PAK1对KIF3A的磷酸化，并通过KIF3A突变体验证功能。
体内验证Rac1在MB和肢芽发育中的作用
确定Rac1在体内Hh信号中的作用。
在GFAP-Cre;SmoM2+/-小鼠和Prx1-Cre;Rac1f/f小鼠中，通过免疫组化和荧光染色检测pPAK1、IFT88、Gli等蛋白表达，并分析表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | N-Shh重组蛋白 | R&D Systems | 464-SH |
| 环杷明 | Selleckchem | -- | |
| SAG | Selleckchem | -- | |
| NSC23766 | Selleckchem | -- | |
| IPA-3 | -- | -- | |
| 细胞处理 | MG132 | Beyotime | -- |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | Sigma | -- |
| 转染 | Lipofectamine转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| RT-qPCR | SuperScript III逆转录酶 | Life Technologies | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 蛋白质制备 | Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | -- |
| 谷胱甘肽琼脂糖4B | GE Healthcare | -- | |
| Western blot | 增强化学发光系统 | -- | -- |
| 抗体 | PAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2602 |
| 磷酸化PAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2601 | |
| 磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9631 | |
| Smo抗体 | Abcam | ab236465 | |
| 磷酸化Vav2抗体 | Abcam | ab86695 | |
| Gli1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20687 | |
| Gli2抗体 | Bioss | bs-11564R | |
| Vav2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271442 | |
| 乙酰化α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23950 | |
| c-Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| KIF3A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376680 | |
| SuFu抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10933 | |
| IFT88抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-84318 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| Rac1抗体 | Bioss | bs-4186R | |
| Rac2抗体 | Huabio | ER61092 | |
| Rac3抗体 | Huabio | ER61093 | |
| GST抗体 | Yeasen | 30901ES10 | |
| Flag抗体 | Beyotime | AF0036 | |
| HA抗体 | Beyotime | AF2305 | |
| Arl13b抗体 | Proteintech | 17711-1-AP | |
| 免疫荧光 | Alexa 488/555荧光二抗 | Life Technology | -- |
| 免疫组化 | Zsbio免疫组化试剂盒 | Zsbio | -- |
| 蛋白质制备 | Amicon Ultra超滤管 | Millipore | -- |
| 质谱分析 | 电喷雾电离四极杆飞行时间质谱 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | C3H10T1/2、HEK293T和MEFs使用高糖DMEM+10%FBS；JEG-3使用DMEM/F12+10%FBS；培养条件37°C,5%CO2 阅读提示：Materials & Methods, Cell Lines |
| 药物处理 | N-Shh浓度100 ng/ml，作用时间24h；SAG浓度50 nM；Cyclopamine浓度5 μM；NSC23766浓度10 μg/ml；IPA-3浓度1 μM；CHX浓度100 μg/ml；MG132浓度10 μM 阅读提示：Figure legends 1-5 and Materials & Methods |
| 基因操作 | 使用shRNA或CRISPR/Cas9敲除或敲低基因；转染方法使用Lipofectamine；嘌呤霉素筛选浓度2 μg/ml 阅读提示：Materials & Methods, CRISPR/Cas9 Construction and Transfection, Oligonucleotides, Viruses and Infections |
| 报告基因实验 | 使用8×Gli结合位点荧光素酶报告基因，内参海肾荧光素酶；转染后处理24h；多次独立重复 阅读提示：Figure legends 1-5 and Materials & Methods, Luciferase Reporter Assays |
| 蛋白检测 | 免疫印迹中蛋白上样量50μg；抗体稀释比例和货号；使用ImageJ定量，以GAPDH或αTubulin为内参 阅读提示：Materials & Methods, Western blot and Immunoprecipitation |