检测circ-RNF111在胃癌组织和细胞中的表达
评估circ-RNF111在胃癌中的表达水平及其稳定性。
采用qRT-PCR检测31例胃癌组织和配对癌旁组织及胃癌细胞系（AGS、SNU-638）和正常胃上皮细胞（GES-1）中circ-RNF111的表达；用RNase R处理RNA样本验证circ-RNF111的环状结构。
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circ-RNF111通过miR-876-3p依赖性调控KLF12加重胃癌恶性程度
Circ-RNF111 aggravates the malignancy of gastric cancer through miR-876-3p-dependent regulation of KLF12.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（CCK-8、集落形成、迁移侵袭、凋亡周期、糖酵解）、分子机制验证（双荧光素酶、RIP）、体内异种移植模型及临床组织样本检测。
主要模型
胃癌组织及癌旁组织 胃癌细胞系AGS和SNU-638 正常胃黏膜上皮细胞GES-1 BALB/c裸鼠异种移植模型
重点核对
胃癌细胞系AGS和SNU-638及正常胃上皮细胞GES-1的来源和培养条件 si-circ-RNF111（#1和#2）及circ-RNF111过表达质粒的转染效率 miR-876-3p mimics和inhibitor的处理浓度和时间 体内实验中sh-circ-RNF111稳定转染的AGS细胞接种数量（2×10^5）及小鼠分组（每组5只） 关键实验的重复次数（三次独立实验）及统计方法
摘要
背景：环状RNA（circRNA）的异常表达在人类癌症（包括胃癌（GC））的进展中起着重要作用。本研究探讨了环状RNA环指蛋白111（circ-RNF111）在胃癌中的功能。方法：采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测circ-RNF111、microRNA-876-3p（miR-876-3p）和Krüppel样因子12（KLF12）mRNA的水平。进行RNase R实验以验证circ-RNF111的特征。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验、集落形成实验、伤口愈合实验和Transwell实验分别检测细胞活力、集落形成、迁移和侵袭。采用流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期进程。使用特定的商业试剂盒检测糖酵解水平。采用Western blot实验检测己糖激酶2（HK-2）和KLF12的蛋白水平。采用双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀（RIP）实验验证miR-876-3p与circ-RNF111或KLF12之间的结合。构建小鼠异种移植模型以研究circ-RNF111在体内的作用。采用免疫组织化学（IHC）检测KLF12水平。结果：circ-RNF111在胃癌组织和细胞中的表达高于正常组织和细胞。沉默circ-RNF111在体外抑制胃癌细胞的活力、集落形成、迁移、侵袭、细胞周期进程和糖酵解，并诱导凋亡。circ-RNF111通过吸附miR-876-3p正向调控KLF12的表达。miR-876-3p的下调逆转了circ-RNF111沉默对胃癌细胞恶性表型的影响。miR-876-3p过表达抑制胃癌细胞生长、转移和糖酵解，抑制凋亡并阻滞细胞周期，而KLF12升高减弱了这些效应。此外，circ-RNF111敲低在体内抑制肿瘤生长。结论：circ-RNF111敲低通过调节miR-876-3p/KLF12轴缓解胃癌的发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circ-RNF111在胃癌中的表达及其对胃癌恶性进展的影响和潜在分子机制。
- 核心机制
- circ-RNF111作为miR-876-3p的海绵，吸附并下调miR-876-3p，从而解除对KLF12的抑制作用，上调KLF12表达，进而促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解，抑制凋亡。
- 主要证据
- 体外实验中，circ-RNF111敲低抑制胃癌细胞活力、集落形成、迁移、侵袭和糖酵解并诱导凋亡；miR-876-3p抑制剂逆转上述效应；双荧光素酶和RIP实验验证circ-RNF111与miR-876-3p及miR-876-3p与KLF12的直接结合；体内异种移植实验显示circ-RNF111敲低抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 研究揭示了circ-RNF111/miR-876-3p/KLF12轴在胃癌进展中的作用，为胃癌的治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验验证circ-RNF111对胃癌细胞恶性表型的影响
探究circ-RNF111对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和糖酵解的影响。
通过siRNA转染敲低circ-RNF111，采用CCK-8、集落形成、流式细胞术、伤口愈合、Transwell实验和糖酵解检测试剂盒评估细胞活力、集落形成、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭和糖酵解水平；Western blot检测相关蛋白表达。
验证circ-RNF111与miR-876-3p的直接结合
验证circ-RNF111是否作为ceRNA吸附miR-876-3p。
通过双荧光素酶报告基因和RIP实验验证circ-RNF111与miR-876-3p的结合；qRT-PCR检测miR-876-3p在胃癌组织和细胞中的表达及与circ-RNF111的相关性。
验证miR-876-3p对胃癌细胞恶性表型的影响及与KLF12的靶向关系
探究miR-876-3p在胃癌中的作用及其靶基因。
通过转染miR-876-3p mimics或inhibitor，进行功能实验；通过双荧光素酶和RIP验证miR-876-3p与KLF12的结合；Western blot检测KLF12蛋白水平。
体内实验验证circ-RNF111对肿瘤生长的影响
验证circ-RNF111在体内对肿瘤形成的影响。
将稳定敲低circ-RNF111（sh-circ-RNF111）或对照（sh-NC）的AGS细胞皮下注射至BALB/c裸鼠，监测肿瘤体积和重量，并通过qRT-PCR、Western blot和IHC检测肿瘤组织中的分子变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | RNAiso Plus | Takara | -- |
| PrimeScript™ RT试剂盒 | Takara | -- | |
| TaqMan miRNA检测试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Premix DimerEraser | Takara | -- | |
| 引物 | Sangon | -- | |
| RNA稳定性分析 | RNase R | Epicentre | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| circ-RNF111小干扰RNA #1 | GenePharma | -- | |
| circ-RNF111小干扰RNA #2 | GenePharma | -- | |
| circ-RNF111过表达质粒 | GenePharma | -- | |
| miR-876-3p模拟物 | GenePharma | -- | |
| miR-876-3p抑制剂 | GenePharma | -- | |
| KLF12过表达质粒 | GenePharma | -- | |
| circ-RNF111短发夹RNA | GenePharma | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sangon | -- |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | Sangon | -- | |
| RNA酶 | Solarbio | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | BD Biosciences | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 糖酵解检测 | 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ATP检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| SDS-PAGE凝胶 | Solarbio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 二抗 | Bioss | bs-0295M-HRP | |
| ECL化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| HK-2抗体 | Bioss | bs-3993R | |
| CyclinD1抗体 | Bioss | bs-0623R | |
| MMP9抗体 | Bioss | bs-4593R | |
| KLF12抗体 | Bioss | bs-16783R | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pmirGLO载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| RIP实验 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| IgG抗体 | -- | -- | |
| Ago2抗体 | -- | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | Sangon | -- | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Bioss | bs-23103R |
| 数据分析 | GraphPad Prism 7 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本采集 | 癌和癌旁组织的来源、患者的临床信息、伦理审批和知情同意 阅读提示：Materials and methods: Tissues acquisition |
| 细胞培养 | 细胞系（GES-1、AGS、SNU-638）的来源、培养基成分（DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素）和培养条件（37°C、湿润） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| qRT-PCR | 引物序列、内参基因（GAPDH和U6）、RNA提取和反转录试剂及方法 阅读提示：Materials and methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）的使用量、转染时间、siRNA和质粒的浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection |
| CCK-8实验 | 细胞接种密度（5×10^3/孔）、培养时间（48小时）、CCK-8孵育时间（2小时）和检测波长（450 nm） 阅读提示：Materials and methods: Cell counting kit-8 (CCK-8) assay |
| 集落形成实验 | 细胞接种数量、培养时间（14天）、结晶紫染色和计数方法 阅读提示：Materials and methods: Colony formation assay |
| 流式细胞术 | 凋亡检测试剂盒、PI染色步骤、细胞周期分析的固定和染色条件 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry analysis |
| 伤口愈合和Transwell实验 | 伤口愈合实验的划痕时间点（0和24小时）、Transwell的细胞数量、基质胶包被、孵育时间（24小时）和染色方法 阅读提示：Materials and methods: Wound-healing assay; Transwell assay |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP水平的检测试剂盒及其操作步骤 阅读提示：Materials and methods: Measurement of glycolysis level |
| Western blot | 蛋白提取方法、抗体信息（包括稀释比例）、封闭条件（5%脱脂牛奶1小时）、二抗孵育时间（1.5小时） 阅读提示：Materials and methods: Western blot assay |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 重组质粒（WT/MUT-circ-RNF111和WT/MUT-KLF12 3'UTR）的构建、共转染的细胞和检测系统 阅读提示：Materials and methods: Dual-luciferase reporter assay |
| RIP实验 | 细胞裂解液与抗体（Ago2或IgG）的结合、RNA提取和qRT-PCR检测 阅读提示：Materials and methods: RNA immunoprecipitation (RIP) assay |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）、每组数量（5只）、细胞接种量（2×10^5）、注射体积（0.2 mL PBS）、肿瘤测量时间点（每5天）和实验终点（32天） 阅读提示：Materials and methods: Murine xenograft model |
| 免疫组织化学 | 抗体（KLF12和Ki-67）的稀释度和孵育条件、染色步骤 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry (IHC) assay |