BMSCs和ADSCs的分离与培养
获取并扩增两种间充质干细胞以进行后续实验。
从大鼠骨髓和腹股沟皮下脂肪组织分别分离BMSCs和ADSCs,并通过反复贴壁法和酶消化法纯化,在含10%FBS的DMEM/F12中培养。
Comparison of the differentiation abilities of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and adipose-derived mesenchymal stem cells toward nucleus pulposus-like cells in three-dimensional culture.
包含细胞分离、表型鉴定、3D培养、活力检测、染色、RT-qPCR和Western blot等体外实验,但缺乏体内动物模型验证,证据层级较单一。
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs) 三维水凝胶培养体系
BMSCs和ADSCs的分离方法(反复贴壁法和酶消化法) 3D培养体系(生物活性水凝胶试剂盒,细胞密度1x10^6/ml) 分化诱导培养基成分(TGF-β1 10 ng/ml, 地塞米松100 nmol/l等)及低氧条件(2% O2) 诱导培养时间(7天) 标志物检测(HIF-1α、GLUT1、Sox-9、聚集蛋白聚糖、II型胶原)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取并扩增两种间充质干细胞以进行后续实验。
从大鼠骨髓和腹股沟皮下脂肪组织分别分离BMSCs和ADSCs,并通过反复贴壁法和酶消化法纯化,在含10%FBS的DMEM/F12中培养。
验证分离的细胞确实是间充质干细胞。
通过流式细胞术检测BMSCs和ADSCs的表面标志物表达。
在3D水凝胶环境中诱导两种细胞向类髓核细胞分化。
使用3D细胞培养水凝胶试剂盒构建3D培养体系,并用分化培养基在低氧条件下培养7天。
评估不同培养条件下两种细胞的增殖能力。
通过CCK-8实验检测细胞活力。
检测细胞外基质中GAG和蛋白聚糖的分泌情况。
用阿尔辛蓝和番红O染色观察GAG和蛋白聚糖形成。
检测髓核标记物和软骨特异性基因的表达水平。
通过RT-qPCR和Western blot检测HIF-1α、GLUT1、Sox-9、聚集蛋白聚糖和II型胶原的mRNA和蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 青霉素 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 链霉素 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 流式分析 | 抗CD29抗体 | BIOSS | bs-20630R-FITC |
| 抗CD90抗体 | BIOSS | bs-0778R-FITC | |
| 抗CD45抗体 | BIOSS | bs-10599R-FITC | |
| 抗CD34抗体 | BIOSS | bs-0646R-FITC | |
| 抗大鼠Sca-1抗体 | BIOSS | bs-3752R-FITC | |
| 抗CD44抗体 | BIOSS | bs-0521R-FITC | |
| 抗CD11b抗体 | BIOSS | bs-1014R-FITC | |
| CyFlow Space流式细胞仪 | Sysmex Partec GmbH | -- | |
| 3D培养 | 3D细胞培养水凝胶试剂盒 | Shanghai Fushen Biotechnology Co., Ltd. | FS0469 |
| 细胞培养 | 转化生长因子-β1 | PeproTech, Inc. | 96-100-21-2 |
| 地塞米松 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8040 | |
| 抗坏血酸 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8100 | |
| 脯氨酸 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P0011 | |
| ITS-Plus培养基补充物 | Collaborative Biomedical Products, Inc. | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | BIOSS | -- |
| 3D培养细胞释放 | 裂解液 | Shanghai Fushen Biotechnology Co., Ltd. | FS0469-B |
| 染色 | 阿尔辛蓝 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G1563 |
| 番红O | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G2540 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| TB Green Premix ExTaq试剂盒 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Merck KGaA | -- | |
| 抗Sox-9抗体 | BIOSS | bs-4177R | |
| 抗HIF-1α抗体 | BIOSS | bs-0737R | |
| 抗GLUT1抗体 | BIOSS | bs-20173R | |
| 抗聚集蛋白聚糖抗体 | BIOSS | bs-1223R | |
| 抗II型胶原抗体 | BIOSS | bsm-33409M | |
| 抗β-actin抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | AC038 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (H+L) | ABclonal Biotech Co., Ltd. | AS014 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (H+L) | ABclonal Biotech Co., Ltd. | AS003 | |
| ECL化学发光试剂 | Merck KGaA | -- | |
| ImageJ 2x软件 | National Institutes of Health | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离 | BMSCs分离采用全骨髓反复贴壁法;ADSCs分离采用酶消化法(0.1%胶原酶,37°C,2小时)。大鼠品系、年龄、体重(3只雄性SD大鼠,6-8周龄,约200g)。 阅读提示:Materials and methods: Isolation of BMSCs and ADSCs |
| 细胞鉴定 | 流式细胞术检测表面标志物:BMSCs为CD29、CD90阳性,CD45、CD34阴性;ADSCs为Sca-1、CD44阳性,CD45、CD11b阴性。抗体稀释比例和孵育时间(2小时,室温,避光)。 阅读提示:Materials and methods: Identification of BMSCs and ADSCs |
| 3D培养和诱导分化 | 3D培养体系:使用3D细胞培养水凝胶试剂盒(cat. no. FS0469),细胞密度1x10^6/ml,凝胶化5-10分钟。分化培养基成分及浓度(TGF-β1 10 ng/ml、地塞米松100 nmol/l、抗坏血酸50 mg/ml、丙酮酸钠100 mg/ml、脯氨酸40 mg/ml、ITS-Plus),低氧条件(2% O2),培养7天。 阅读提示:Materials and methods: 3D culture and grouping |
| 细胞活力检测 | CCK-8实验:细胞接种量3x10^4/孔,培养48小时,3D培养细胞需用裂解液释放,检测波长450 nm。 阅读提示:Materials and methods: Cell viability |
| 染色检测 | 阿尔辛蓝染色和番红O染色的固定时间、染色时间和温度(阿尔辛蓝:4%多聚甲醛20分钟,1%染液4小时;番红O:4%多聚甲醛30分钟,染液30分钟)。 阅读提示:Materials and methods: Visualization of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and proteoglycans |
| 基因和蛋白表达 | RT-qPCR:RNA提取(Trizol)、反转录(PrimeScript RT试剂盒)、qPCR(TB Green Premix ExTaq)、内参(GAPDH)、基因(HIF-1α、GLUT1、Sox-9、aggrecan、collagen II)。Western blot:蛋白提取(RIPA)、定量(BCA)、上样量30 μg、SDS-PAGE(10%)、一抗稀释比例(1:1000)、内参(β-actin)。 阅读提示:Materials and methods: Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) assay; Western blot assay |