三维培养中骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞向类髓核细胞分化能力的比较

Comparison of the differentiation abilities of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and adipose-derived mesenchymal stem cells toward nucleus pulposus-like cells in three-dimensional culture.

作者信息Xuejun Dai, Yanyu Guan, Zhongzi Zhang, Ying Xiong, Chengwei Liu, Haifeng Li, Bailian Liu
PMID34373704
发布时间2021-09
DOI10.3892/etm.2021.10450

实验完整度

包含细胞分离、表型鉴定、3D培养、活力检测、染色、RT-qPCR和Western blot等体外实验,但缺乏体内动物模型验证,证据层级较单一。

主要模型

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs) 三维水凝胶培养体系

重点核对

BMSCs和ADSCs的分离方法(反复贴壁法和酶消化法) 3D培养体系(生物活性水凝胶试剂盒,细胞密度1x10^6/ml) 分化诱导培养基成分(TGF-β1 10 ng/ml, 地塞米松100 nmol/l等)及低氧条件(2% O2) 诱导培养时间(7天) 标志物检测(HIF-1α、GLUT1、Sox-9、聚集蛋白聚糖、II型胶原)

摘要

髓核细胞(NPC)移植可能是椎间盘退变(IDD)的潜在治疗方法。然而,低细胞活力限制了NPC的治疗能力,且天然NPC的来源有限。骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)可分化为类髓核细胞。然而,这两种细胞类型分化为类髓核细胞的能力是否存在差异,或者哪种细胞类型表现出最佳的分化能力,尚不清楚。本研究比较了在有或无3D培养系统的情况下BMSCs和ADSCs分化为类髓核细胞的能力,以期为IDD的干细胞移植治疗奠定基础。采用反复贴壁培养法从大鼠全骨髓细胞中分离BMSCs。采用酶消化法从大鼠腹股沟皮下脂肪组织中分离ADSCs。通过流式细胞术鉴定细胞。通过Cell Counting Kit-8实验评估细胞活力,并通过逆转录定量PCR和western blotting评估髓核标记物和软骨细胞特异性基因的表达。分别通过阿尔辛蓝和番红O染色检测糖胺聚糖(GAGs)和蛋白聚糖。与2D培养系统和BMSC培养相比,3D培养中的ADSCs表现出最高的细胞增殖能力。此外,3D培养中的ADSCs比BMSCs表现出更高的GAG和蛋白聚糖合成。与3D培养中的BMSCs相比,3D培养中的ADSCs表现出更高的髓核标记基因(缺氧诱导因子1-α、葡萄糖转运蛋白1)和软骨细胞特异性基因(Sox-9、聚集蛋白聚糖和II型胶原)的mRNA和蛋白表达。本研究结果表明,在3D培养中,ADSCs比BMSCs具有更好的分化为类髓核细胞的能力,这可能对使用细胞移植疗法再生椎间盘具有价值。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
在3D培养条件下,骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞分化为类髓核细胞的能力是否存在差异?
核心机制
3D培养环境结合低氧和分化培养基可促进间充质干细胞向类髓核细胞分化,其中ADSCs表现出更高的分化潜能。
主要证据
CCK-8实验显示3D培养中ADSCs增殖能力更高;阿尔辛蓝和番红O染色显示3D培养中ADSCs产生更多GAG和蛋白聚糖;RT-qPCR和Western blot显示ADSCs在3D培养中高表达HIF-1α、GLUT1、Sox-9、聚集蛋白聚糖和II型胶原。
研究意义
为椎间盘退变相关疾病的细胞治疗提供候选细胞选择的参考,ADSCs可能更适合作为种子细胞。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

BMSCs和ADSCs的分离与培养

获取并扩增两种间充质干细胞以进行后续实验。

从大鼠骨髓和腹股沟皮下脂肪组织分别分离BMSCs和ADSCs,并通过反复贴壁法和酶消化法纯化,在含10%FBS的DMEM/F12中培养。

2

细胞表面标志物鉴定

验证分离的细胞确实是间充质干细胞。

通过流式细胞术检测BMSCs和ADSCs的表面标志物表达。

3

3D培养和分组诱导分化

在3D水凝胶环境中诱导两种细胞向类髓核细胞分化。

使用3D细胞培养水凝胶试剂盒构建3D培养体系,并用分化培养基在低氧条件下培养7天。

4

细胞活力检测

评估不同培养条件下两种细胞的增殖能力。

通过CCK-8实验检测细胞活力。

5

GAG和蛋白聚糖染色

检测细胞外基质中GAG和蛋白聚糖的分泌情况。

用阿尔辛蓝和番红O染色观察GAG和蛋白聚糖形成。

6

基因和蛋白表达分析

检测髓核标记物和软骨特异性基因的表达水平。

通过RT-qPCR和Western blot检测HIF-1α、GLUT1、Sox-9、聚集蛋白聚糖和II型胶原的mRNA和蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM/F12培养基Thermo Fisher Scientific, Inc.--
胎牛血清Thermo Fisher Scientific, Inc.--
青霉素Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.--
链霉素Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.--
胶原酶Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.--
抗CD29抗体BIOSSbs-20630R-FITC
抗CD90抗体BIOSSbs-0778R-FITC
抗CD45抗体BIOSSbs-10599R-FITC
抗CD34抗体BIOSSbs-0646R-FITC
抗大鼠Sca-1抗体BIOSSbs-3752R-FITC
抗CD44抗体BIOSSbs-0521R-FITC
抗CD11b抗体BIOSSbs-1014R-FITC
CyFlow Space流式细胞仪Sysmex Partec GmbH--
3D细胞培养水凝胶试剂盒Shanghai Fushen Biotechnology Co., Ltd.FS0469
转化生长因子-β1PeproTech, Inc.96-100-21-2
地塞米松Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8040
抗坏血酸Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.A8100
脯氨酸Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.P0011
ITS-Plus培养基补充物Collaborative Biomedical Products, Inc.--
细胞计数试剂盒-8BIOSS--
裂解液Shanghai Fushen Biotechnology Co., Ltd.FS0469-B
阿尔辛蓝Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G1563
番红OBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G2540
Trizol试剂Takara Biotechnology Co., Ltd.--
PrimeScript RT试剂盒Takara Biotechnology Co., Ltd.--
TB Green Premix ExTaq试剂盒Takara Biotechnology Co., Ltd.--
RIPA裂解液Beyotime Institute of Biotechnology--
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime Institute of Biotechnology--
PVDF膜Merck KGaA--
抗Sox-9抗体BIOSSbs-4177R
抗HIF-1α抗体BIOSSbs-0737R
抗GLUT1抗体BIOSSbs-20173R
抗聚集蛋白聚糖抗体BIOSSbs-1223R
抗II型胶原抗体BIOSSbsm-33409M
抗β-actin抗体ABclonal Biotech Co., Ltd.AC038
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (H+L)ABclonal Biotech Co., Ltd.AS014
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)ABclonal Biotech Co., Ltd.AS003
ECL化学发光试剂Merck KGaA--
ImageJ 2x软件National Institutes of Health--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞分离
BMSCs分离采用全骨髓反复贴壁法;ADSCs分离采用酶消化法(0.1%胶原酶,37°C,2小时)。大鼠品系、年龄、体重(3只雄性SD大鼠,6-8周龄,约200g)。
阅读提示:Materials and methods: Isolation of BMSCs and ADSCs
细胞鉴定
流式细胞术检测表面标志物:BMSCs为CD29、CD90阳性,CD45、CD34阴性;ADSCs为Sca-1、CD44阳性,CD45、CD11b阴性。抗体稀释比例和孵育时间(2小时,室温,避光)。
阅读提示:Materials and methods: Identification of BMSCs and ADSCs
3D培养和诱导分化
3D培养体系:使用3D细胞培养水凝胶试剂盒(cat. no. FS0469),细胞密度1x10^6/ml,凝胶化5-10分钟。分化培养基成分及浓度(TGF-β1 10 ng/ml、地塞米松100 nmol/l、抗坏血酸50 mg/ml、丙酮酸钠100 mg/ml、脯氨酸40 mg/ml、ITS-Plus),低氧条件(2% O2),培养7天。
阅读提示:Materials and methods: 3D culture and grouping
细胞活力检测
CCK-8实验:细胞接种量3x10^4/孔,培养48小时,3D培养细胞需用裂解液释放,检测波长450 nm。
阅读提示:Materials and methods: Cell viability
染色检测
阿尔辛蓝染色和番红O染色的固定时间、染色时间和温度(阿尔辛蓝:4%多聚甲醛20分钟,1%染液4小时;番红O:4%多聚甲醛30分钟,染液30分钟)。
阅读提示:Materials and methods: Visualization of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and proteoglycans
基因和蛋白表达
RT-qPCR:RNA提取(Trizol)、反转录(PrimeScript RT试剂盒)、qPCR(TB Green Premix ExTaq)、内参(GAPDH)、基因(HIF-1α、GLUT1、Sox-9、aggrecan、collagen II)。Western blot:蛋白提取(RIPA)、定量(BCA)、上样量30 μg、SDS-PAGE(10%)、一抗稀释比例(1:1000)、内参(β-actin)。
阅读提示:Materials and methods: Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) assay; Western blot assay