验证TRIM21为ISGylation底物
确定TRIM21是否被ISG15修饰
在HEK293细胞中共转染ISG15系统与候选基因，免疫沉淀和免疫印迹检测ISGylated条带；在A549细胞中用IFN-β或IFNA2处理，检测内源性ISGylation。
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IFN-β诱导的TRIM21 ISGylation增强p62泛素化以阻止其自噬体靶向
Induced TRIM21 ISGylation by IFN-β enhances p62 ubiquitination to prevent its autophagosome targeting.
实验完整度
高包含体外HEK293细胞转染、CRISPR/Cas9基因敲除A549细胞、稳定回补、LC-MS/MS、免疫共沉淀、免疫荧光和共聚焦成像等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293细胞 A549细胞 TRIM21-/- A549细胞 TRIM21-/- A549细胞稳定回补野生型或突变体TRIM21
重点核对
HEK293细胞转染ISG15系统及TRIM21突变体 A549细胞经IFN-β处理（2000单位/ml，48小时） TRIM21基因敲除（CRISPR/Cas9，单碱基插入导致移码） 稳定回补野生型TRIM21或TRIM21(5KR)突变体 K63连接泛素化检测（变性RIPA缓冲液免疫沉淀）
摘要
三结构域蛋白21（TRIM21）在自噬和先天免疫中发挥重要作用。在此，我们发现HECT和RLD结构域包含的E3泛素蛋白连接酶5（HERC5），作为干扰素刺激基因15（ISG15）E3连接酶，催化TRIM21在Lys260和Lys279残基的ISGylation。此外，IFN-β还诱导TRIM21在多个赖氨酸残基上的ISGylation，从而增强其K63连接特异性泛素化的E3连接酶活性，导致TRIM21和p62的K63连接泛素化水平增加。p62在Lys7的K63连接泛素化阻止其自身寡聚化和靶向自噬体。综上所述，我们的研究表明TRIM21的ISGylation在调节IFN-β诱导的自噬中p62的自身寡聚化和定位中发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IFN-β诱导的TRIM21 ISGylation如何调控p62的自噬体靶向？
- 核心机制
- HERC5催化TRIM21在Lys260和Lys279的ISGylation，增强其K63连接特异性E3连接酶活性，促进p62的K63连接泛素化，阻止p62自身寡聚化和自噬体定位。
- 主要证据
- 通过LC-MS/MS鉴定ISGylation位点；在HEK293细胞中过表达ISG15系统或ISG15融合TRIM21增强K63连接泛素化；在A549细胞中IFN-β处理诱导TRIM21 ISGylation和p62泛素化，TRIM21敲除或5KR突变体回补阻断该效应；免疫荧光显示TRIM21敲除增加p62与自噬体共定位。
- 研究意义
- 揭示ISGylation调节p62寡聚化和自噬体靶向的新机制，为理解IFN-β诱导自噬的调控提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定催化TRIM21 ISGylation的E3连接酶
确定哪个ISG15 E3连接酶介导TRIM21的ISGylation
分别共表达HERC5、EFP、HHARI与TRIM21，免疫共沉淀检测相互作用，并敲低各E3连接酶检测对TRIM21 ISGylation的影响。
鉴定TRIM21的ISGylation位点
确定TRIM21上主要的ISGylation赖氨酸残基
免疫沉淀TRIM21-Flag，SDS-PAGE分离，胶内酶解，LC-MS/MS分析鉴定位点；构建突变体验证位点功能。
验证ISGylation增强TRIM21的K63连接E3连接酶活性
确定ISGylation是否影响TRIM21的E3连接酶活性及其连接特异性
在HEK293细胞中将TRIM21或ISG15融合TRIM21与泛素突变体共转染，进行泛素化实验。
验证IFN-β诱导的TRIM21 ISGylation促进p62的K63连接泛素化
确定ISGylated TRIM21是否影响p62的K63连接泛素化
在TRIM21+/+和TRIM21-/- A549细胞中，IFN-β处理后检测p62的K63连接泛素化水平；在TRIM21-/-细胞中回补野生型或5KR突变体TRIM21，检测恢复效果。
验证ISGylated TRIM21阻止p62自噬体靶向
确证ISGylation对p62寡聚化和自噬体定位的影响
在A549细胞中过表达mCherry-LC3，免疫荧光染色检测p62与自噬体共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | WISENT INC. | 319-005-CL |
| RPMI 1640培养基 | WISENT INC. | 350-600-CL | |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| 链霉素-青霉素 | WISENT INC. | 450-201-el | |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 | |
| 免疫共沉淀和免疫印迹 | Western及IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | bimake | B14002 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | bimake | B15001 | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖 | Thermo Scientific | 20422 |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Merck millipore | HATF00010 |
| ECL化学发光试剂 | Bio-rad | 1705061 | |
| ChemiDoc XRS+凝胶成像系统 | Bio-Rad | 1708265 | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRNzol Universal试剂 | TIANGEN | DP424 |
| 5× EasyQuick RT预混液 | CWBIO | CW2020M | |
| LightCycler实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 2× UltraSYBR预混液 | CWBIO | CW0957M | |
| 泛素化实验 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013K |
| 基因敲除细胞系构建 | px458载体 | -- | -- |
| TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304-02 | |
| 慢病毒包装 | 聚乙二醇6000 | -- | -- |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| LC-MS/MS分析 | 抗Flag亲和凝胶 | bimake | B23102 |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Easy-nLC 1200纳升液相色谱 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫荧光染色 | 玻璃底培养皿 | NEST | 801002 |
| 4%甲醛 | -- | -- | |
| 皂苷 | -- | -- | |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔二抗 | Bioss | bs-0295G-AF647 | |
| 免疫荧光成像 | Andor Dragonfly转盘共聚焦显微镜 | Andor | -- |
| 免疫荧光定量 | Imaris图像分析软件 | Bitplane | -- |
| 免疫印迹抗体 | 小鼠对照IgG | CST | 3900S |
| 辣根过氧化物酶标记的马抗小鼠IgG | CST | 7076S | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | CST | 7074S | |
| 兔抗HA抗体 | CST | 3724S | |
| 兔抗Flag抗体 | CST | 2368S | |
| 小鼠抗Flag抗体 | EASYBIO | BE2004-100 | |
| 小鼠抗Myc抗体 | CST | 2276S | |
| 兔抗TRIM21抗体 | proteintech | 12108-1-AP | |
| 兔抗UBE1L抗体 | proteintech | 15818-1-AP | |
| 兔抗UBCH8抗体 | proteintech | 17278-1-AP | |
| 兔抗HERC5抗体 | GeneTex | GTX130167 | |
| 小鼠抗HHARI抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-390763 | |
| 兔抗ISG15抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-50366 | |
| 兔抗肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC004 | |
| 兔抗p62抗体 | CST | 5114S | |
| 兔抗泛素（Lys63特异性）抗体 | Merk millipore | 05-1308 | |
| 药物处理 | 巴弗洛霉素A1 | Selleck | S1413 |
| 细胞因子处理 | IFNA2 | Sino Biological | 13833-HNAS |
| IFN-β | Sino Biological | 10704-HNAS |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | HEK293细胞使用DMEM培养基，A549细胞使用RPMI 1640培养基，均添加10% FBS和1%链霉素-青霉素；HEK293用PEI转染，A549用Lipofectamine 3000转染。 阅读提示：参见Materials and methods中的Cell culture and transfection |
| ISGylation检测 | IFN-β处理浓度（2000单位/ml）和持续时间（48小时）；ISG15-GG/AA突变体；USP18共表达；免疫沉淀抗体和条件。 阅读提示：参见Results中“TRIM21 is ISGylated by HERC5”和图1、图2 |
| ISGylation位点鉴定 | LC-MS/MS分析中使用的TRIM21-Flag及ISG15系统；突变体（K260R、K279R、2KR、3KR、5KR）的构建。 阅读提示：参见Results中“Identification of Lys260 and Lys279 in TRIM21 as the major ISGylation sites”和图3 |
| 泛素化实验 | RT-qPCR中使用TRNzol Universal Reagent提取RNA，5× EasyQuick RT MasterMix逆转录，LightCycler检测，2× UltraSYBR Mixture扩增；qRT-PCR引物序列；内参基因actin。 阅读提示：参见Materials and methods中的RNA extraction and qRT-PCR |
| 基因敲除细胞系构建 | CRISPR/Cas9 sgRNA靶向TRIM21第二外显子；px458载体；流式分选单细胞；基因组DNA提取和测序验证插入G导致移码。 阅读提示：参见Materials and methods中的Generation of TRIM21 KO A549 cells |
| 稳定细胞系构建 | 慢病毒包装质粒VSV-G、pRRE、RSV-Rev；PEG6000浓缩病毒；polybrene感染；嘌呤霉素筛选（1μg/ml，2周）。 阅读提示：参见Materials and methods中的Construction of stable cell lines with lentivirus和Short hairpin RNAs |
| 免疫荧光染色 | 细胞固定（4%甲醛）、透化（0.5% saponin）、封闭（5%山羊血清）、一抗（anti-p62）和二抗（Alexa Fluor 647标记）孵育条件；共聚焦显微镜观察。 阅读提示：参见Materials and methods中的Immunofluorescence staining and imaging和图6 |