miRNA 表达谱筛选
鉴定 AIV 感染 PAM 细胞后差异表达的 miRNAs
使用 H5N1 AIV (MOI=1) 感染 PAM 细胞 24 小时，进行小 RNA 深度测序，筛选高丰度差异表达 miRNAs
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猪 microRNAs ssc-miR-221-3p 和 ssc-miR-222 限制禽流感病毒的跨种感染
Swine MicroRNAs ssc-miR-221-3p and ssc-miR-222 Restrict the Cross-Species Infection of Avian Influenza Virus.
实验完整度
高包含体外细胞模型（PAM、NPTr、293T）的病毒感染、miRNA 过表达/敲低、双荧光素酶报告、ChIP、细胞凋亡检测等多层级验证，并明确功能与机制。
主要模型
猪肺泡巨噬细胞 (PAM) 细胞 新生猪气管上皮 (NPTr) 细胞 HEK293T 细胞
重点核对
禽流感病毒感染 PAM 细胞时 MOI=1，感染后 24 小时时进行 miRNA 测序分析 PAM 细胞转染 50 nM miRNA mimics，MOI=1 感染 H5N1 AIV，6 hpi 时通过 IFA 和流式细胞术检测感染率 qRT-PCR 检测过表达 ssc-miR-221-3p/222 后不同时间点（12/24/36/48 hpi）的 M1 mRNA 水平 双荧光素酶报告实验验证 ssc-miR-221-3p 靶向 HA，ssc-miR-222 靶向 PA，突变靶位点消除抑制效应 ChIP 实验验证 P65 结合 miR-221-3p/222 启动子，PAM 细胞中 P65 敲低降低 pri-miRNA 表达
摘要
禽流感病毒能够跨越物种屏障感染人类和其他哺乳动物。然而，这些跨物种传播通常因宿主限制而成为终末感染。目前关于宿主限制的研究主要集中在细胞膜、核膜和宿主蛋白的屏障作用上；microRNAs 是否在宿主限制中发挥作用在很大程度上尚不清楚。在本研究中，我们使用猪肺泡巨噬细胞作为模型来阐明 miRNAs 在宿主范围限制中的作用。在禽流感病毒感染期间，在猪肺泡巨噬细胞中筛选出 40 个表达失调的 miRNAs。其中，两个猪 miRNAs，ssc-miR-221-3p 和 ssc-miR-222，能够通过直接靶向病毒基因组并通过抑制抗凋亡蛋白 HMBOX1 的表达诱导细胞凋亡，从而抑制禽流感病毒在猪肺泡巨噬细胞中的感染和复制。禽流感病毒而非猪流感病毒引起猪肺泡巨噬细胞中 ssc-miR-221-3p 和 ssc-miR-222 的表达上调。我们进一步发现，禽流感病毒感染时 NF-κB P65 的磷酸化更有效，且 P65 作为转录激活因子调节禽流感病毒诱导的 miR-221-3p/222 的表达。重要的是，我们发现 ssc-miR-221-3p 和 ssc-miR-222 在新生猪气管上皮细胞中也能被禽流感病毒感染特异性上调，并发挥抗禽流感病毒功能。总之，我们的研究表明 miRNAs 在流感病毒的跨种感染中充当宿主屏障。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主 miRNAs 是否以及在多大程度上参与限制禽流感病毒跨种感染猪的机制。
- 核心机制
- AIV 感染通过诱导 NF-κB P65 磷酸化导致 P65 核转位，与 miR-221-3p/222 启动子结合并激活其转录；ssc-miR-221-3p 和 ssc-miR-222 通过直接靶向病毒 HA 和 PA mRNA 以及抑制 HMBOX1 表达诱导凋亡，从而抑制 AIV 复制。
- 主要证据
- PAM 和 NPTr 细胞中 AIV 感染上调 miRNA 表达，SIV 无此效应；过表达 miRNA 降低感染率和病毒滴度；双荧光素酶和 ChIP 实验证明靶向结合和 P65 结合；miRNA 过表达诱导凋亡，而 HMBOX1 敲低模拟 miRNA 效应。
- 研究意义
- 揭示 miRNAs 作为宿主范围限制因子，限制流感病毒跨种感染，为理解宿主-病毒相互作用及防控流感提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miRNA 功能验证
验证差异 miRNAs 对 AIV 感染和复制的影响
PAM 和 NPTr 细胞转染 miRNA mimics 或对照，感染 H5N1 AIV，检测 NP 蛋白、M1 mRNA、病毒滴度
靶向病毒 RNA 验证
证明 ssc-miR-221-3p 和 ssc-miR-222 直接靶向病毒基因
293T 细胞共转染含有 AIV 各基因片段的 pGL3 报告质粒和 miRNA mimics，进行双荧光素酶报告实验，并对预测靶位点进行突变验证
靶向宿主基因验证
验证 miRNA 通过靶向 HMBOX1 诱导细胞凋亡
预测并验证宿主靶基因，双荧光素酶报告实验，Western blot 检测 HMBOX1 蛋白水平，siRNA 敲低 HMBOX1 验证凋亡效应
转录调控机制解析
阐明 AIV 感染上调 miRNA 表达的转录调控机制
检测 pri-miRNA 和 pre-miRNA 表达，构建启动子报告质粒，预测并验证转录因子 P65 结合位点，ChIP 验证 P65 结合
表达特异性验证
确认 miRNA 仅被 AIV 而非 SIV 感染上调
PAM 和 NPTr 细胞分别感染不同亚型 AIV (H5N1, H7N9, H9N2) 和 SIV (H1N1, H3N2)，检测 miRNA 表达变化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640 培养基 | Invitrogen | -- |
| DMEM 培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| jetPRIME 转染试剂 | Polyplus | -- | |
| miRNA 转染 | miRNA 模拟物 | Gene Pharma | -- |
| siRNA 转染 | 小干扰 RNA | Gene Pharma | -- |
| Western blot | 抗 β-actin 抗体 | Beyotime | AA128 |
| 抗 GAPDH 抗体 | Beyotime | AF0006 | |
| 抗 NP 抗体 | GenScript | A01506 | |
| 抗 NF-κB P65 抗体 | Cell Signaling Technology | 6956 | |
| 抗磷酸化 NF-κB P65 (Ser536) 抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗 IκBα 抗体 | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| 抗磷酸化 IκBα (Ser32) 抗体 | Bioss | bsm-52169R | |
| 抗 HMBOX1 抗体 | Bioss | bs-18047R | |
| 抗 Bcl2 抗体 | Bioss | bsm-33047M | |
| 抗 caspase 3/P17/P19 抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗 NP 抗体（免疫荧光用） | Abcam | ab20343 |
| Western blot | HRP 偶联山羊抗兔 IgG | Beyotime | A0208 |
| HRP 偶联山羊抗小鼠 IgG | Beyotime | A0216 | |
| 免疫荧光 | FITC 偶联山羊抗小鼠 IgG | Abcam | ab6785 |
| RNA 提取 | TRIzol 试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA 裂解液 | -- | -- |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF 膜 | Bio-Rad | -- | |
| Western Lightning 化学发光试剂盒 | Amersham | -- | |
| qRT-PCR | oligo(dT) 引物 | Promega | C1181 |
| Superscript III 第一链合成 SuperMix | Invitrogen | -- | |
| miRNA 提取试剂盒 | Gene Pharma | -- | |
| 2× SYBR green PCR 预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| Light Cycler 96 实时荧光定量 PCR 仪 | Roche | -- | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | -- | -- |
| 流式细胞术 | Foxp3 固定/透化缓冲液 | -- | -- |
| 凋亡检测 | PE Annexin V 凋亡检测试剂盒 I | BD Biosciences | -- |
| 双荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告检测系统试剂盒 | Promega | -- |
| ChIP | SimpleChIP 酶解染色质免疫沉淀试剂盒（磁珠法） | Cell Signaling Technology | -- |
| miRNA 测序 | NEBNext 多重小 RNA 文库制备试剂盒（Illumina） | New England BioLabs (NEB) | -- |
| Illumina HiSeq 2500/2000 测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | PAM 细胞来源和培养条件，NPTr、293T、MDCK 细胞的培养条件 阅读提示：Materials and Methods: Cells and viruses |
| 病毒感染 | 病毒感染使用的病毒株、MOI、感染时间、感染效率验证 阅读提示：Figure legends for Fig. 1, 2, 3, 7, 10, 14, 15, 16, 17 |
| miRNA 转染 | miRNA mimics 及对照浓度、转染试剂、转染时间、敲低效率 阅读提示：Materials and Methods: Reagents, Plasmids; Figure legends for Fig. 1C, 2, 3, 8, 9, 16, 17 |
| qRT-PCR | 引物序列、RNA 提取方法、内参选择（GAPDH 或 U6）、相对定量计算 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative real-time PCR |
| 双荧光素酶报告 | 报告质粒构建、转染浓度、检测时间、内参质粒使用 阅读提示：Materials and Methods: Luciferase assay; Figure legends for Fig. 4, 9, 12, 13 |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒、染色步骤、流式分析门控设置 阅读提示：Materials and Methods: Apoptosis detection; Figure legend for Fig. 8 |
| ChIP | 细胞数量、交联条件、超声条件、抗体选择、qPCR 引物 阅读提示：Materials and Methods: ChIP; Figure legend for Fig. 13D |