精浆蛋白质组作为鸡精子功能障碍和低精子活力的指标

Seminal Plasma Proteome as an Indicator of Sperm Dysfunction and Low Sperm Motility in Chickens.

作者信息Yunlei Li, Yanyan Sun, Aixin Ni, Lei Shi, Panlin Wang, Adamu Mani Isa, Pingzhuang Ge, Linlin Jiang, Jing Fan, Hui Ma, Gongshe Yang, Jilan Chen
PMID32312844
发布时间2020-06
DOI10.1074/mcp.RA120.002017

实验完整度

研究包含多层级验证:基于无标记定量蛋白质组学鉴定差异蛋白,并通过Western blot验证;进一步测定精子ATP、线粒体膜电位、质膜完整性、顶体完整性、ROS、MDA和T-AOC等多项功能指标,构成多证据链。

主要模型

北京油鸡(BJY)公鸡精液样本 低精子活力和高精子活力公鸡模型

重点核对

公鸡分组:从210只BJY公鸡中筛选出精子活力最低的4只(LSM)和最高的4只(HSM),依据精子活力和精液量初步选择,并排除精液量异常个体。 精子活力测定:使用CASA系统(ML-608JZII)在41周龄时测定,每组重复3次,间隔2天。 精浆蛋白鉴定:采用SDS-PAGE分级(每条泳道切4段)后进行LC-MS/MS分析,每样本30 μg蛋白,PNGase F处理,Orbitrap Fusion质谱仪鉴定。 差异蛋白筛选标准:FDR校正p值<0.1且差异倍数>1.5。 功能验证实验:测定精子ATP、ΔΨm、质膜完整性、顶体完整性、ROS、MDA和T-AOC,样本量为每组4只,统计分析使用双尾Student's t检验。

摘要

精子活力的分子机制尚未完全阐明,尤其是在鸡中。本研究旨在通过比较低精子活力(LSM,n = 4)和高精子活力(HSM,n = 4)公鸡的精浆蛋白质组谱,鉴定与鸡精子活力相关的精浆蛋白。采用基于无标记质谱的方法,共鉴定出522个精浆蛋白,包括386个(约74%)先前报道的蛋白和136个新蛋白。共定义70个差异丰度蛋白,包括48个丰度较高、15个丰度较低和7个仅在LSM组中出现的蛋白(特异性蛋白)。LSM中关键的分泌蛋白如丰度较低的黏附G蛋白偶联受体G2(ADGRG2)和丰度较高的丝氨酸肽酶抑制剂Kazal型2(SPINK2)提示相应的分泌组织在维持精子活力中起关键作用。LSM中丰度较高蛋白和5个特异性蛋白中大多数(80%)被注释到细胞质结构域,这可能是由于LSM中质膜损伤和顶体功能障碍所致。此外,在LSM精浆中检测到丰度较高的线粒体蛋白,与较低的精子线粒体膜电位(ΔΨm)和ATP浓度相关。进一步研究表明,精子可能遭受氧化应激,因为精子活性氧(ROS)含量大幅增加,精浆丙二醛(MDA)浓度升高,精浆总抗氧化能力(T-AOC)降低。我们的研究提供了鸡精浆蛋白质组的额外目录,并支持精浆可作为精子生理状态指标的观点。精浆中顶体、线粒体和精子细胞骨架蛋白丰度较高可能是精子功能障碍和活力丧失的标志。由精浆T-AOC降低和氧化应激增强引起的精子退化可能是低精子活力的潜在决定因素。这些结果可加深我们对精子活力和精子生理调节的理解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
鸡精浆蛋白组是否与精子活力相关,以及低精子活力的分子机制是什么?
核心机制
ROS诱导的精子降解和线粒体功能障碍可能是低精子活力的潜在决定因素。
主要证据
基于无标记质谱鉴定出70个差异蛋白,其中线粒体蛋白丰度升高,精子ATP和ΔΨm降低,质膜和顶体完整性受损,ROS升高,MDA升高,T-AOC降低,且Western blot验证了部分蛋白。
研究意义
本研究提供了鸡精浆蛋白质组的额外目录,支持精浆可作为精子生理状态的指标,有助于理解精子活力和精子生理调节。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

精液质量评价与分组

筛选出精子活力显著不同的公鸡用于后续蛋白质组学分析。

对210只BJY公鸡进行精子活力和精液量检测,选择精子活力最低和最高的各4只公鸡,进一步使用CASA系统测定精子运动参数,并评估生育力。

2

精浆蛋白提取与质谱鉴定

鉴定低和高精子活力组精浆中的差异表达蛋白。

收集精浆,通过离心去除精子,SDS-PAGE分离后切胶,进行酶解,使用LC-MS/MS进行无标记定量蛋白质组学分析。

3

差异蛋白验证

通过Western blot验证质谱定量结果。

对四个差异蛋白(CKMT2、CYC、GAPDH和IL6ST)进行Western blot分析,以总蛋白为内参。

4

精子功能检测

评估低精子活力精子的功能状态,包括能量代谢、膜完整性、顶体完整性和氧化应激水平。

测定精子ATP水平、线粒体膜电位(ΔΨm)、血浆膜完整性、顶体完整性、ROS水平,以及精浆MDA和T-AOC。

5

统计分析

评估差异的统计学显著性。

使用Student's t检验比较LSM和HSM组之间的表型差异,蛋白质组数据使用FDR校正的t检验。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
BCA蛋白定量试剂盒Tiangen Biotech Co., LtdPA115-01
肽-N-糖苷酶FNew England BiolabsP0704S
10% SDS-PAGE凝胶GenScript Biotech CorpM42012C
胰蛋白酶溶液PromegaV5111
Acclaim™ PepMap™ 100 C18液相色谱柱Thermo Fisher Scientific Inc.--
Orbitrap Fusion质谱仪Thermo Fisher Scientific Inc.--
PVDF膜Merck-Millipore--
抗CKMT2抗体Proteintech13207-1-AP
抗CYC抗体Biossbs-0013R
抗GAPDH抗体Proteintech10494-1-AP
抗IL6ST抗体Biossbs-5151R
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)ProteintechSA00001-2
CCD相机系统Tanon--
增强型ATP检测试剂盒BeyotimeS0027
JC-1线粒体膜电位检测试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdM8650
GENMED试剂盒GENMED Scientifics Inc.GMS14017
吉姆萨染液Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdG1010
活性氧检测试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdCA1410
MDA检测试剂盒Nanjing Jiancheng Biotech Co., Ltd.A003-1
T-AOC检测试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdBC1310
多功能酶标仪TECAN--
蛋白质组发现者Thermo Fisher Scientific Inc.--
pH计(SevenCompact S210)Mettler-Toledo instruments Co., Ltd--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
实验分组与精液选择
分组标准:从210只BJY公鸡中筛选精子活力最低和最高的各4只;排除精液量异常、水样或污染精液;精子活力测定方法、样本量(n=4)和重复次数。
阅读提示:Experimental Procedures: Experimental Design and Statistical Rationale 和 Animals
精浆蛋白提取与定量
离心条件:2000×g 5分钟,再12000×g 20分钟两次;PMSF浓度(0.2 mm);蛋白质定量方法(BCA试剂盒);储存条件(液氮,-80°C)。
阅读提示:Experimental Procedures: Sample Collection and Preparation
蛋白质组学分析
样品量(30 μg);SDS-PAGE凝胶浓度(10%);每条泳道切4段;酶解条件(胰蛋白酶,12小时,37°C);质谱仪型号(Orbitrap Fusion);液相条件(流速、梯度)和蛋白质鉴定参数(FDR<0.01,肽段数等)。
阅读提示:Experimental Procedures: In-gel Digestion and LC-MS/MS 和 Protein Identification and Quantification
功能验证实验
ATP测定:精子数量(~2×10^7)和试剂盒(S0027);ΔΨm测定:精子数量(~1×10^6)和JC-1孵育时间(20分钟);质膜完整性测定:精液量(10 μl)和低渗液孵育时间(30分钟);顶体完整性测定:精子稀释倍数(1:100)和染色时间(30分钟);ROS测定:精子浓度(10×10^6/ml)和DCFH-DA浓度(1 μm)及孵育时间(15分钟);MDA测定:样品类型(精浆);T-AOC测定:样品类型(精浆)。
阅读提示:Experimental Procedures: Spermatozoa ATP Levels, Spermatozoa ΔΨm, Spermatozoa Plasma Membrane Integrity, Spermatozoa Acrosome Integrity, Spermatozoa ROS Level, Seminal Plasma MDA, Seminal Plasma T-AOC
统计分析
统计方法:双尾Student's t检验;显著性阈值:表型数据p<0.05,蛋白质组数据FDR<0.1且FC>1.5;数据处理:百分比数据反正弦转换,结果以均值±标准误表示。
阅读提示:Experimental Procedures: Statistical Analysis