精液质量评价与分组
筛选出精子活力显著不同的公鸡用于后续蛋白质组学分析。
对210只BJY公鸡进行精子活力和精液量检测,选择精子活力最低和最高的各4只公鸡,进一步使用CASA系统测定精子运动参数,并评估生育力。
Seminal Plasma Proteome as an Indicator of Sperm Dysfunction and Low Sperm Motility in Chickens.
研究包含多层级验证:基于无标记定量蛋白质组学鉴定差异蛋白,并通过Western blot验证;进一步测定精子ATP、线粒体膜电位、质膜完整性、顶体完整性、ROS、MDA和T-AOC等多项功能指标,构成多证据链。
北京油鸡(BJY)公鸡精液样本 低精子活力和高精子活力公鸡模型
公鸡分组:从210只BJY公鸡中筛选出精子活力最低的4只(LSM)和最高的4只(HSM),依据精子活力和精液量初步选择,并排除精液量异常个体。 精子活力测定:使用CASA系统(ML-608JZII)在41周龄时测定,每组重复3次,间隔2天。 精浆蛋白鉴定:采用SDS-PAGE分级(每条泳道切4段)后进行LC-MS/MS分析,每样本30 μg蛋白,PNGase F处理,Orbitrap Fusion质谱仪鉴定。 差异蛋白筛选标准:FDR校正p值<0.1且差异倍数>1.5。 功能验证实验:测定精子ATP、ΔΨm、质膜完整性、顶体完整性、ROS、MDA和T-AOC,样本量为每组4只,统计分析使用双尾Student's t检验。
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选出精子活力显著不同的公鸡用于后续蛋白质组学分析。
对210只BJY公鸡进行精子活力和精液量检测,选择精子活力最低和最高的各4只公鸡,进一步使用CASA系统测定精子运动参数,并评估生育力。
鉴定低和高精子活力组精浆中的差异表达蛋白。
收集精浆,通过离心去除精子,SDS-PAGE分离后切胶,进行酶解,使用LC-MS/MS进行无标记定量蛋白质组学分析。
通过Western blot验证质谱定量结果。
对四个差异蛋白(CKMT2、CYC、GAPDH和IL6ST)进行Western blot分析,以总蛋白为内参。
评估低精子活力精子的功能状态,包括能量代谢、膜完整性、顶体完整性和氧化应激水平。
测定精子ATP水平、线粒体膜电位(ΔΨm)、血浆膜完整性、顶体完整性、ROS水平,以及精浆MDA和T-AOC。
评估差异的统计学显著性。
使用Student's t检验比较LSM和HSM组之间的表型差异,蛋白质组数据使用FDR校正的t检验。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学:蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Tiangen Biotech Co., Ltd | PA115-01 |
| 蛋白质组学:去糖基化 | 肽-N-糖苷酶F | New England Biolabs | P0704S |
| 蛋白质组学:SDS-PAGE | 10% SDS-PAGE凝胶 | GenScript Biotech Corp | M42012C |
| 蛋白质组学:酶解 | 胰蛋白酶溶液 | Promega | V5111 |
| 蛋白质组学:液相色谱 | Acclaim™ PepMap™ 100 C18液相色谱柱 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| 蛋白质组学:质谱 | Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| Western blot:转膜 | PVDF膜 | Merck-Millipore | -- |
| Western blot:抗体 | 抗CKMT2抗体 | Proteintech | 13207-1-AP |
| 抗CYC抗体 | Bioss | bs-0013R | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗IL6ST抗体 | Bioss | bs-5151R | |
| Western blot:二抗 | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 |
| Western blot:成像 | CCD相机系统 | Tanon | -- |
| 精子功能:ATP测定 | 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| 精子功能:ΔΨm测定 | JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | M8650 |
| 精子功能:质膜完整性 | GENMED试剂盒 | GENMED Scientifics Inc. | GMS14017 |
| 精子功能:顶体完整性 | 吉姆萨染液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | G1010 |
| 精子功能:ROS测定 | 活性氧检测试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | CA1410 |
| 精子功能:MDA测定 | MDA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Biotech Co., Ltd. | A003-1 |
| 精子功能:T-AOC测定 | T-AOC检测试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | BC1310 |
| 精子功能:读板 | 多功能酶标仪 | TECAN | -- |
| MS数据分析 | 蛋白质组发现者 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| 精液分析:pH测定 | pH计(SevenCompact S210) | Mettler-Toledo instruments Co., Ltd | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 实验分组与精液选择 | 分组标准:从210只BJY公鸡中筛选精子活力最低和最高的各4只;排除精液量异常、水样或污染精液;精子活力测定方法、样本量(n=4)和重复次数。 阅读提示:Experimental Procedures: Experimental Design and Statistical Rationale 和 Animals |
| 精浆蛋白提取与定量 | 离心条件:2000×g 5分钟,再12000×g 20分钟两次;PMSF浓度(0.2 mm);蛋白质定量方法(BCA试剂盒);储存条件(液氮,-80°C)。 阅读提示:Experimental Procedures: Sample Collection and Preparation |
| 蛋白质组学分析 | 样品量(30 μg);SDS-PAGE凝胶浓度(10%);每条泳道切4段;酶解条件(胰蛋白酶,12小时,37°C);质谱仪型号(Orbitrap Fusion);液相条件(流速、梯度)和蛋白质鉴定参数(FDR<0.01,肽段数等)。 阅读提示:Experimental Procedures: In-gel Digestion and LC-MS/MS 和 Protein Identification and Quantification |
| 功能验证实验 | ATP测定:精子数量(~2×10^7)和试剂盒(S0027);ΔΨm测定:精子数量(~1×10^6)和JC-1孵育时间(20分钟);质膜完整性测定:精液量(10 μl)和低渗液孵育时间(30分钟);顶体完整性测定:精子稀释倍数(1:100)和染色时间(30分钟);ROS测定:精子浓度(10×10^6/ml)和DCFH-DA浓度(1 μm)及孵育时间(15分钟);MDA测定:样品类型(精浆);T-AOC测定:样品类型(精浆)。 阅读提示:Experimental Procedures: Spermatozoa ATP Levels, Spermatozoa ΔΨm, Spermatozoa Plasma Membrane Integrity, Spermatozoa Acrosome Integrity, Spermatozoa ROS Level, Seminal Plasma MDA, Seminal Plasma T-AOC |
| 统计分析 | 统计方法:双尾Student's t检验;显著性阈值:表型数据p<0.05,蛋白质组数据FDR<0.1且FC>1.5;数据处理:百分比数据反正弦转换,结果以均值±标准误表示。 阅读提示:Experimental Procedures: Statistical Analysis |