细胞系PNI能力筛选
筛选具有神经周围浸润能力的宫颈癌细胞系
将七种宫颈癌细胞系（HeLa、ME-180、SiHa、CaSki、C33A、MS751、HCC94）分别与DRG共培养，观察癌细胞与神经突的相互作用。
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施万细胞来源的CCL2促进宫颈癌的神经周围浸润
Schwann Cell-Derived CCL2 Promotes the Perineural Invasion of Cervical Cancer.
实验完整度
高包含体外细胞共培养、DRG模型、体内坐骨神经注射模型、临床样本分析等多个独立证据层级，并通过shRNA敲低、拮抗剂处理等进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HeLa和ME-180宫颈癌细胞系 大鼠背根神经节（DRG）共培养模型 小鼠坐骨神经PNI模型 宫颈癌患者组织样本和血清样本
重点核对
细胞系：HeLa、ME-180（宫颈癌细胞系）及RSC96（大鼠施万细胞系） 体外共培养：DRG或RSC与癌细胞共培养，检测迁移和侵袭 CCL2浓度：50、100 ng/ml处理癌细胞 CCR2拮抗剂：RS102895处理 shRNA：靶向CCR2的shRNA（sh7732、sh7733、sh7734）稳定敲低
摘要
神经周围浸润（PNI）对于宫颈癌的神经保留具有指导意义，但目前尚无明确的标志物指示PNI。两种宫颈癌细胞系（HeLa和ME-180）在体外和体内均表现出显著的沿神经突迁移的能力。形态学观察显示，施万细胞（SC）在癌症转移开始前就已到达宫颈癌细胞的位置。我们使用高通量抗体芯片筛选介导神经细胞和癌细胞相互作用的信号，发现背根神经节（DRG）中CCL2高表达。同时，血清CCL2显著升高，尤其是在宫颈腺癌中。SC来源的CCL2与其受体CCR2结合，促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）。反过来，癌细胞来源的信号触发SC中金属蛋白酶（MMPs）包括MMP2、MMP9和MMP12的表达，促进SC溶解基质。这些数据表明，癌症-神经串扰形成了有利于PNI的肿瘤微环境（TME）。我们确定CCL2/CCR2轴是预测宫颈癌PNI并影响神经保留的潜在标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 施万细胞在宫颈癌神经周围浸润（PNI）中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- SC来源的CCL2与癌细胞膜上的CCR2结合，促进癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，而癌细胞信号上调SC中MMP2/9/12的表达，促进基质降解，形成利于PNI的肿瘤微环境。
- 主要证据
- 体外共培养实验显示SC来源CCL2促进癌细胞迁移，CCR2拮抗剂或shRNA敲低可抑制；体内坐骨神经注射模型显示敲低CCR2减小神经直径和评分；临床样本显示CCL2/CCR2表达与PNI相关。
- 研究意义
- CCL2/CCR2轴可能作为预测宫颈癌PNI的潜在标志物，并影响保留神经的根治性子宫切除术（NSRH）的适应症选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内PNI模型验证
验证宫颈癌细胞在体内是否发生神经周围浸润
将HeLa和ME-180细胞注射到裸鼠坐骨神经，5周后观察PNI发生并检测神经组织中癌细胞浸润。
细胞相互作用观察
观察施万细胞与宫颈癌细胞之间的相互作用
通过共培养和延时摄影，观察SCs向癌细胞迁移以及癌细胞沿神经突移向DRG的过程。
CCL2/CCR2轴验证
验证CCL2/CCR2轴在PNI中的作用
使用ELISA、RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测CCL2和CCR2表达，使用CCL2刺激和CCR2拮抗剂或shRNA敲低验证功能。
EMT和细胞骨架分析
探讨CCL2/CCR2轴对癌细胞EMT和细胞骨架的影响
通过Western blot检测EMT标志物变化，FITC-phalloidin染色观察细胞骨架形态。
临床样本分析
评估CCL2/CCR2在宫颈癌患者中的表达及临床意义
ELISA检测血清CCL2水平，免疫组化检测组织CCR2表达，并分析其与PNI的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 细胞迁移和侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 结晶紫染色液 | YEASEN | -- | |
| Western blot | CCR2抗体 | Cell Signaling Technology | 12199S |
| MCP1抗体 | Abcam | ab25124 | |
| MMP9抗体 | Abcam | ab76003 | |
| MMP2抗体 | Abcam | ab92536 | |
| MMP12抗体 | Abcam | ab52897 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | CST-5174T | |
| EMT抗体套装 | Cell Signaling Technology | CST-9782 | |
| 组织学分析 | CCR2抗体 | Bioss | bs-0562R |
| N-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab18203 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195T | |
| Snail抗体 | Bioss | bs-1371R | |
| Slug抗体 | Bioss | bs-1382R | |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成SuperMix试剂盒 | TransGen Biotech | -- | |
| QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | CCR2抗体 | Biolegend | 357208 |
| Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | CST-9449S | |
| FACS Calibur流式细胞仪 | BD | -- | |
| 免疫荧光 | 广谱细胞角蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | CST-4544 |
| PGP9.5抗体 | ThermoFisher | PA5-16825 | |
| 神经丝重链抗体 | ThermoFisher | PA3-16753 | |
| IV型胶原抗体 | Abcam | ab6586 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | ThermoFisher | A-11006 | |
| Alexa Fluor 594二抗 | ThermoFisher | A-11007 | |
| CCL2抗体 | Abcam | ab9899 | |
| 免疫荧光（小鼠组织） | MMP9抗体 | Proteintech | 10375-2-AP |
| MMP2抗体 | Proteintech | 10373-2-AP | |
| ELISA | MCP-1免疫分析试剂盒 | BOSTER | EK0902 |
| 慢病毒感染 | 靶向CCR2的shRNA | Obio Technology | sh7732, |
| 体内PNI实验 | Hamilton微量进样器 | -- | -- |
| FITC-Phalloidin染色 | FITC-鬼笔环肽工作液 | Beyotime | C1033 |
| 细胞标记 | CellTracker CM-DiI荧光染料 | YEASEN | 40718ES50 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与培养条件 | 细胞系（HeLa、ME-180等）来源、培养基（DMEM、McCoys 5A、RPMI-1640）、血清浓度（10% FCS）、培养环境（5% CO2, 37°C） 阅读提示：Methods - Cell Cultures |
| 体外PNI模型 | DRG分离方法（SD大鼠）、Matrigel用量（2.5 μL）、癌细胞种植位置（外周）、共培养时间（2-3天）、观察时间间隔（24小时） 阅读提示：Methods - In vitro Neural Invasion Assay, Figure 1B |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞数量（1×10^5）、基质胶使用、DRG或RSC置于下室、迁移时间（20小时）、侵袭时间（36小时）、固定染色方法（4%多聚甲醛、结晶紫） 阅读提示：Methods - Cell Migration and Invasion Assays |
| CCL2/CCR2功能验证 | CCL2浓度（10, 25, 50, 100 ng/ml）、CCR2拮抗剂（RS102895）浓度、shRNA序列（sh7732, sh7733, sh7734）、感染和筛选（嘌呤霉素） 阅读提示：Methods - Lentivirus Infection, Results - CCL2/CCR2 Axis Enhances... |
| 体内坐骨神经注射模型 | 小鼠品系（裸鼠）、麻醉方式（异氟烷）、细胞数量（3×10^5）、注射体积（3 μL）、注射位置（神经外膜下）、观察时间（5周） 阅读提示：Methods - In vivo Perineural Invasion Assay |
| 临床样本分析 | 血清样本数量（正常15例，癌33例）、组织样本数量（正常16例，PNI 20例，非PNI 20例）、ELISA试剂盒（BOSTER MCP-1 kit）、免疫组化抗体（CCR2） 阅读提示：Methods - ELISA Assay, Histological Analysis, Results - Expression and Clinical Significance |