体内验证线粒体功能在卵泡发育中的变化
评估卵泡发育过程中颗粒细胞线粒体活性、基因表达和蛋白质合成的变化。
收集23日龄小鼠注射eCG后0、24、48小时的颗粒细胞,检测线粒体活性、膜电位、mt-DNA拷贝数、基因表达和蛋白质水平。
Mitochondrial Protein Turnover Is Critical for Granulosa Cell Proliferation and Differentiation in Antral Follicles.
包含体内(eCG处理小鼠)和体外(GC培养)实验,并进行了功能验证(CRP抑制)和机制验证。
小鼠颗粒细胞 小鼠卵巢窦状卵泡 eCG处理小鼠模型
eCG注射剂量和时间(4 IU,0/24/48小时) CRP浓度(0.1 mM) 培养时间(24小时) 葡萄糖浓度(17.51 mM, 5.56 mM, 无葡萄糖)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估卵泡发育过程中颗粒细胞线粒体活性、基因表达和蛋白质合成的变化。
收集23日龄小鼠注射eCG后0、24、48小时的颗粒细胞,检测线粒体活性、膜电位、mt-DNA拷贝数、基因表达和蛋白质水平。
确定FSH和睾酮(FT)处理是否增加颗粒细胞线粒体基因表达和蛋白质合成。
收集eCG启动6小时后的小鼠颗粒细胞,在DMEM/F12中加入FSH和睾酮培养24小时,检测线粒体基因表达和蛋白质水平。
通过CRP抑制线粒体翻译,评估其对颗粒细胞增殖和分化的影响。
在FT处理的培养体系中加入CRP,检测线粒体活性、膜电位、ATP含量、BrdU掺入和分化标记基因表达。
探究颗粒细胞ATP产生是否不依赖于培养基中的葡萄糖浓度。
在不同葡萄糖浓度(高、低、无)的DMEM培养基中培养颗粒细胞,检测增殖和ATP含量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物处理 | 马绒毛膜促性腺激素 | Asuka Seiyaku | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 |
| 低糖DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11885-084 | |
| 无糖DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 药物处理 | d-氯霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取和逆转录 | RNAeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| 禽骨髓母细胞瘤病毒逆转录酶 | Promega | -- | |
| 实时荧光定量PCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| StepOne实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| DNA提取 | QIAamp DNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| 线粒体活性检测 | MitoTracker Green FM | -- | M-7514 |
| 线粒体膜电位检测 | MitoPT JC-1检测试剂盒 | Immunochemistry Technologies | -- |
| 流式细胞术 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞增殖检测 | BrdU细胞增殖ELISA试剂盒 | Abcam | ab126556 |
| ATP检测 | EnzyLight ATP检测试剂盒 | Bioassay Systems | EATP-100 |
| 多功能读板机 | 2030 ARVO X3多功能读板机 | PerkinElmer | -- |
| 2030 ARVO X4多功能读板机 | PerkinElmer | -- | |
| Western blotting | 抗MT-ND1抗体 | Proteintech Group | 19703-1-AP |
| 抗MT-ND6抗体 | Bioss | bs-3955R | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| HRP偶联的抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP偶联的抗鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| Fuji X射线胶片 | Fujifilm | -- | |
| 图像分析 | Gel-Pro分析软件 | Media Cybernetics | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与体内实验 | 小鼠品系(C57BL/6)、年龄(23日龄)、eCG剂量(4 IU)和注射时间(0、24、48小时) 阅读提示:参见Materials and Methods B和C节,以及Figure legends 1和2 |
| 体外培养 | 培养基类型(DMEM/F12、低糖、无糖)、FCS浓度(1%)、FSH浓度(100 ng/mL)、睾酮浓度(10 ng/mL)、CRP浓度(0.1 mM)、培养时间(24小时) 阅读提示:参见Materials and Methods D节,以及Figure legends 3-6 |
| 线粒体功能检测 | MitoTracker Green浓度(20 nM)、JC-1浓度(0.5 μM)、检测仪器和参数(485/535 nm,488 nm激光) 阅读提示:参见Materials and Methods H和I节 |
| 基因表达分析 | RNA提取试剂盒、逆转录酶、PCR条件(退火温度60-64°C)、内参基因(L19) 阅读提示:参见Materials and Methods E和F节,以及Table 1 |
| 蛋白质分析 | 蛋白上样量(10 μg)、SDS-PAGE浓度(12.5%)、抗体稀释和孵育条件、显影方法 阅读提示:参见Materials and Methods L节 |