线粒体蛋白质周转对于窦状卵泡颗粒细胞增殖和分化至关重要

Mitochondrial Protein Turnover Is Critical for Granulosa Cell Proliferation and Differentiation in Antral Follicles.

作者信息S A Masudul Hoque, Tomoko Kawai, Zhendong Zhu, Masayuki Shimada
PMID30652133
发布时间2018-12-10
DOI10.1210/js.2018-00329

实验完整度

包含体内(eCG处理小鼠)和体外(GC培养)实验,并进行了功能验证(CRP抑制)和机制验证。

主要模型

小鼠颗粒细胞 小鼠卵巢窦状卵泡 eCG处理小鼠模型

重点核对

eCG注射剂量和时间(4 IU,0/24/48小时) CRP浓度(0.1 mM) 培养时间(24小时) 葡萄糖浓度(17.51 mM, 5.56 mM, 无葡萄糖)

摘要

颗粒细胞(GC)增殖对于卵泡发育至关重要。FSH 是 GC 增殖的关键因素,持续供应高水平的 ATP 是细胞增殖所必需的。然而,编码糖酵解途径蛋白质的基因在 GC 中表达不佳。因此,我们假设线粒体基因表达和蛋白质合成在 GC 增殖过程中的 ATP 产生中起主要作用。为了验证这一假设,我们对取自 23 日龄小鼠卵巢的 GC 进行了体内研究,这些小鼠接受或不接受马绒毛膜促性腺激素(eCG)启动。观察到,在 eCG 注射 24 小时后,GC 中的线粒体活性(包括膜电位)、蛋白质编码基因(Nd1-6, Cytb, Atpase6,8)和转录相关基因(Polrmt, Tfam, Tfb2m)的表达、线粒体(mt-)DNA 拷贝数以及蛋白质合成均增加,并在 48 小时内大多保持升高。因此,我们在补充有 FSH、睾酮和血清且含有不同葡萄糖浓度,添加或不添加 d-氯霉素(CRP)的 DMEM 培养基中进行了 GC 的体外培养,持续 24 小时。观察到 GC 增殖和 ATP 产生不依赖于葡萄糖浓度。此外,FSH 诱导的线粒体活性(包括膜电位)、ATP 含量、BrdU 掺入的细胞增殖、mt-ND1 和 mt-ND6 蛋白的强度以及增殖和分化标志基因的表达均因 CRP 处理而显著降低。这些结果揭示了线粒体在 ATP 供应中的关键作用,以及线粒体基因表达和蛋白质合成不仅对 GC 增殖而且对卵泡发育过程中的分化都是必需的。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
线粒体基因表达和蛋白质合成是否对窦状卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖和分化至关重要。
核心机制
线粒体基因表达和蛋白质合成通过提供ATP来支持颗粒细胞的增殖和分化。
主要证据
体内实验显示eCG刺激后线粒体活性、膜电位、基因表达、蛋白合成和ATP含量增加;体外实验显示CRP抑制线粒体蛋白质合成后,FSH诱导的增殖和分化标记物表达降低。
研究意义
本研究强调了线粒体在颗粒细胞中的生理重要性,并为女性生育力提供了新的见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体内验证线粒体功能在卵泡发育中的变化

评估卵泡发育过程中颗粒细胞线粒体活性、基因表达和蛋白质合成的变化。

收集23日龄小鼠注射eCG后0、24、48小时的颗粒细胞,检测线粒体活性、膜电位、mt-DNA拷贝数、基因表达和蛋白质水平。

2

体外验证FSH诱导的线粒体功能变化

确定FSH和睾酮(FT)处理是否增加颗粒细胞线粒体基因表达和蛋白质合成。

收集eCG启动6小时后的小鼠颗粒细胞,在DMEM/F12中加入FSH和睾酮培养24小时,检测线粒体基因表达和蛋白质水平。

3

抑制线粒体蛋白质合成验证其对增殖和分化的影响

通过CRP抑制线粒体翻译,评估其对颗粒细胞增殖和分化的影响。

在FT处理的培养体系中加入CRP,检测线粒体活性、膜电位、ATP含量、BrdU掺入和分化标记基因表达。

4

验证ATP产生是否依赖于葡萄糖浓度

探究颗粒细胞ATP产生是否不依赖于培养基中的葡萄糖浓度。

在不同葡萄糖浓度(高、低、无)的DMEM培养基中培养颗粒细胞,检测增殖和ATP含量。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

检测基因和蛋白质表达
检测细胞增殖

产品清单

实验环节名称品牌货号
马绒毛膜促性腺激素Asuka Seiyaku--
DMEM/F12培养基Thermo Fisher Scientific11330-032
低糖DMEMThermo Fisher Scientific11885-084
无糖DMEMThermo Fisher Scientific11966-025
胎牛血清Life Technologies--
d-氯霉素Sigma-Aldrich--
RNAeasy迷你试剂盒Qiagen--
禽骨髓母细胞瘤病毒逆转录酶Promega--
Power SYBR Green PCR预混液Applied Biosystems--
StepOne实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
QIAamp DNA迷你试剂盒Qiagen--
MitoTracker Green FM--M-7514
MitoPT JC-1检测试剂盒Immunochemistry Technologies--
Attune NxT流式细胞仪Thermo Fisher Scientific--
BrdU细胞增殖ELISA试剂盒Abcamab126556
EnzyLight ATP检测试剂盒Bioassay SystemsEATP-100
2030 ARVO X3多功能读板机PerkinElmer--
2030 ARVO X4多功能读板机PerkinElmer--
抗MT-ND1抗体Proteintech Group19703-1-AP
抗MT-ND6抗体Biossbs-3955R
抗β-actin抗体Cell Signaling Technology4967
HRP偶联的抗兔IgG抗体Cell Signaling Technology7074
HRP偶联的抗鼠IgG抗体Cell Signaling Technology7076
Fuji X射线胶片Fujifilm--
Gel-Pro分析软件Media Cybernetics--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型与体内实验
小鼠品系(C57BL/6)、年龄(23日龄)、eCG剂量(4 IU)和注射时间(0、24、48小时)
阅读提示:参见Materials and Methods B和C节,以及Figure legends 1和2
体外培养
培养基类型(DMEM/F12、低糖、无糖)、FCS浓度(1%)、FSH浓度(100 ng/mL)、睾酮浓度(10 ng/mL)、CRP浓度(0.1 mM)、培养时间(24小时)
阅读提示:参见Materials and Methods D节,以及Figure legends 3-6
线粒体功能检测
MitoTracker Green浓度(20 nM)、JC-1浓度(0.5 μM)、检测仪器和参数(485/535 nm,488 nm激光)
阅读提示:参见Materials and Methods H和I节
基因表达分析
RNA提取试剂盒、逆转录酶、PCR条件(退火温度60-64°C)、内参基因(L19)
阅读提示:参见Materials and Methods E和F节,以及Table 1
蛋白质分析
蛋白上样量(10 μg)、SDS-PAGE浓度(12.5%)、抗体稀释和孵育条件、显影方法
阅读提示:参见Materials and Methods L节