验证CnB与TLR4的结合和内化
确定细胞外CnB是否能被细胞摄取并靶向TLR4。
使用CnB偶联罗丹明（CnB-RBITC）孵育U937细胞，通过共聚焦显微镜观察内化；通过免疫共沉淀验证CnB与TLR4相互作用。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
钙调磷酸酶B亚基通过不依赖CD14的Toll样受体4途径刺激细胞因子产生
Calcineurin B stimulates cytokine production through a CD14-independent Toll-like receptor 4 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（U937、HEK293、人PBMCs）、siRNA敲低、突变体功能分析、免疫共沉淀、Western blot、ELISA等多层级验证，并有明确机制验证。
主要模型
人U937单核细胞系 人PBMC来源单核细胞 HEK293细胞过表达TLR4/MD2
重点核对
CD14敲低效率（CD14表达降至13.9%） CnB处理浓度（250 μg/ml）和时间（3h） IκB-α磷酸化时间历程（1.5h达到峰值） TRAF3和TRAF6敲低效率 CnB去磷酸化活性验证（突变体）
摘要
钙调磷酸酶B亚基（CnB）是Ca2+/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶Cn的调节亚基。在本研究中，我们证明细胞外CnB通过不依赖CD14的Toll样受体4（TLR4）途径被有效内化，这导致核因子κB抑制蛋白α（IκB-α）的磷酸化和人单核细胞中促炎细胞因子的上调。CnB诱导的IκB-α磷酸化完全依赖于TNF受体相关因子3（TRAF3）而非TRAF6，而TRAF6对脂多糖诱导的IκB-α磷酸化是不可或缺的。功能缺失的CnB突变体仍能诱导IκB-α磷酸化，进一步表明CnB的这种新作用完全独立于Cn的磷酸酶功能。综上所述，这些发现证明CnB是一种新型的宿主来源的免疫刺激因子，在单核细胞中作为激动剂发挥作用，并通过TRAF3和TRAF6在TLR4信号传导中表现出对不同激动剂的特异性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞外钙调磷酸酶B亚基是否具有细胞因子样功能，以及其作用机制如何？
- 核心机制
- CnB通过CD14非依赖性TLR4途径激活NF-κB信号，经TRAF3而非TRAF6依赖的IκB-α磷酸化，上调促炎细胞因子表达，此过程独立于Cn的磷酸酶活性。
- 主要证据
- U937细胞中CnB诱导IκB-α磷酸化和IL-8/TNF-α上调，TLR4抗体阻断实验，TRAF3敲低抑制Effect，而TRAF6敲低无影响；CnB突变体仍诱导磷酸化。
- 研究意义
- CnB作为宿主来源的免疫刺激因子，通过TRAF3依赖途径调控免疫细胞功能，可能作为抗肿瘤免疫的强效诱导剂和潜在的治疗佐剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测CnB诱导的促炎细胞因子表达
评估CnB是否上调促炎细胞因子表达。
用CnB处理U937细胞，通过定量PCR和ELISA检测IL-8和TNF-α的表达和分泌。
验证CD14非依赖性
确定CnB诱导的细胞因子产生是否依赖CD14。
用CD14 siRNA敲低U937细胞中CD14表达，检测CnB和LPS诱导的细胞因子表达。
验证IκB-α磷酸化及TLR4依赖性
明确CnB信号是否通过TLR4激活NF-κB通路。
Western blot检测IκB-α磷酸化，用TLR4抗体和CnB抗体预处理以阻断信号，并在HEK293细胞中验证TLR4/MD2的作用。
验证TRAF3依赖性
确定CnB诱导的IκB-α磷酸化依赖于哪个TRAF。
使用TRAF3 siRNA和TRAF6 siRNA敲低，检测CnB和LPS诱导的IκB-α磷酸化及细胞因子表达。
检验CnB功能独立于磷酸酶活性
证明CnB诱导的免疫效应与Cn的磷酸酶活性无关。
使用CnB功能缺失突变体（M118E和M118N）处理细胞，检测IκB-α磷酸化，并测定磷酸酶活性。
在人PBMC来源单核细胞中的验证
在生理相关细胞类型中验证CnB的作用。
从健康供体PBMCs中分离单核细胞，用CnB处理不同时间，检测细胞因子分泌和IκB-α磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | 去内毒素凝胶 | Pierce Biotechnology | 20344 |
| 内毒素检测 | 鲎阿米巴细胞裂解物检测试剂盒 | Zhanjiang Bokang Marine Biological co. Ltd | -- |
| 蛋白追踪 | 罗丹明B异硫氰酸酯 | Beijing Biosynthesis Biotechnology | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | GIBCO | -- |
| DMEM培养基 | Sigma | -- | |
| 热灭活胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| 35毫米培养皿 | MatTek | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 奥林巴斯FV300 | Olympus | -- |
| 蛋白浓度测定 | GBC cintra 10e | GBC | -- |
| siRNA转染 | OptiMEM I低血清培养基 | Invitrogen | -- |
| Bio-Rad Genepulser Xcell系统 | BIO-RAD | -- | |
| RNA提取 | RNApure高纯度总RNA快速提取试剂盒 | BioTeke | -- |
| RT-PCR | 逆转录酶M-MLV | TaKaRa | -- |
| Oligo(dT)18引物 | TaKaRa | -- | |
| RNA酶抑制剂 | TaKaRa | -- | |
| dNTP混合物 | TaKaRa | -- | |
| qRT-PCR | LightCycler 1.2实时荧光定量PCR系统 | Roche | -- |
| LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒 | Roche | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A琼脂糖 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- |
| PP2B-B1/2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-33166 | |
| TLR4 (H-80)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10741 | |
| CD14 (M-305)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9150 | |
| IL-8 (H-60)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7922 | |
| IκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 9242 | |
| 磷酸化IκB-α (Ser32/36)小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9246 | |
| TRAF6抗体 | Cell Signaling Technology | 4743 | |
| TRAF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4729 | |
| β-actin抗体 | Biosynthesis biotechnology | bs-0061R | |
| 辣根过氧化物酶标记的亲和纯化山羊抗兔IgG | Jackson | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的亲和纯化山羊抗小鼠IgG | Jackson | -- | |
| 超增强化学发光检测试剂盒 | Applygen Technologies, Inc. | -- | |
| 柯达X射线胶片 | Kodak | -- | |
| 磷酸酶活性测定 | [32P]标记RII肽 | -- | -- |
| AG50W-X8色谱 | BIO-RAD | -- | |
| TRI-CARB 2900TR液体闪烁计数器 | Packard Bioscience | -- | |
| ELISA | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| IL-8 ELISA试剂盒 | RayBio | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | RayBio | -- | |
| PBMC分离 | 淋巴细胞分离液 | HaoYang | -- |
| 单核细胞分离 | MACS分选系统 | Miltenyi Biotec | -- |
| CD14免疫磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| ELISA | IL-8 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- |
| TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | U937细胞系（ATCC CRL-1593.2）和HEK293细胞系；培养基RPMI 1640和DMEM，含10%热灭活胎牛血清 阅读提示：Methods中的Confocal microscopy和ELISA部分 |
| CnB处理 | CnB浓度250 μg/ml，处理时间3小时（部分实验至24小时）；BS作为对照 阅读提示：Methods中的Extract preparation and western blotting和ELISA部分 |
| siRNA敲低 | siRNA浓度100 nM，电穿孔参数240V, 975μF，两次转染间隔约24小时，第二次后约30小时收集细胞 阅读提示：Methods中的Small interference RNA and quantitative RT–PCR部分 |
| Western blot | 抗体浓度和稀释倍数（如TLR4, IκB-α等抗体的使用浓度） 阅读提示：Methods中的Extract preparation and western blotting部分 |
| 免疫沉淀 | 抗体2 μg/ml，孵育时间3-5小时，蛋白A琼脂糖收集 阅读提示：Methods中的Immunoprecipitation部分 |
| ELISA | 细胞处理（CnB 250 μg/ml或LPS 30 μg/ml）3小时，收集上清 阅读提示：Methods中的ELISA部分 |
| 磷酸酶活性测定 | 反应体系（0.2 μM CnB、40 μM [32P]RII、0.6 μM钙调蛋白、0.2mM CaCl2等），30°C孵育10分钟 阅读提示：Methods中的Cn phosphatase activity assay部分 |
| PBMC和单核细胞分离 | 密度梯度离心分离PBMC，CD14免疫磁珠分选单核细胞 阅读提示：Methods中的PBMCs and monocyte isolation部分 |