建立体内和体外朊病毒病模型
模拟朊病毒病的病理过程，用于研究REST及相关信号通路。
通过腹腔接种263K朊病毒株建立仓鼠感染模型；使用PrP106-126处理原代皮层神经元建立体外模型。
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抑制元件1-沉默转录因子（REST）的下调与朊病毒病模型中的Akt-mTOR和Wnt-β-catenin信号通路相关
Downregulation of the Repressor Element 1-Silencing Transcription Factor (REST) Is Associated with Akt-mTOR and Wnt-β-Catenin Signaling in Prion Diseases Models.
实验完整度
高包含体内动物模型（263K感染仓鼠）、体外原代神经元培养，并结合免疫组化、免疫印迹、免疫荧光、ROS检测、线粒体形态分析及功能验证（过表达/敲低REST）等多层级证据。
主要模型
263K感染的叙利亚金黄仓鼠 原代培养皮层神经元（PCCN）
重点核对
动物模型中263K朊病毒株的腹腔接种剂量（75 μl 10%脑匀浆）和疾病分期 体外PrP106-126肽的处理浓度（200 μM或300 μM）和时间（3-60 h） REST过表达或敲低使用的载体（pCMV-HA-Rest、shRNA）转染条件 信号通路蛋白的磷酸化位点检测（p-Akt Ser473、p-mTOR Ser2448、p-β-catenin Ser552、p-GSK3β Ser9）
摘要
朊病毒病是一组以多种神经病理学变化为特征的传染性疾病，但维持功能并预防朊病毒相关神经变性的机制仍不清楚。我们之前报道过抑制元件1-沉默转录因子（REST）减轻了原代神经元中神经毒性朊病毒肽（PrP106-126）诱导的毒性。在此，我们证实了体外模型在263K感染的仓鼠（一种朊病毒病的体内模型）中的发现，并进一步展示了REST与相关信号通路之间的关系。REST在感染朊病毒的脑内从细胞核中耗竭，并被自噬体摄取至细胞质中，与LC3-II共定位。重要的是，Akt-mTOR信号通路的下调以及LRP6-Wnt-β-catenin信号通路的至少部分失活与体内263K感染仓鼠脑内和体外PrP106-126处理的原代神经元中REST水平的降低相关。在原代皮层神经元中过表达REST减轻了PrP106-126肽诱导的神经元氧化应激、线粒体损伤以及LRP6-Wnt-β-catenin和Akt-mTOR信号通路的部分抑制。基于我们的发现，提出了一个模型，其中REST介导的神经保护在朊病毒感染动物中发挥作用，Akt-mTOR和Wnt-β-catenin信号通路是关键通路。REST介导的神经元存活信号可被探索作为朊病毒病和相关神经退行性疾病的可行治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究REST在朊病毒病中的表达和分布变化，以及其与Akt-mTOR和Wnt-β-catenin信号通路的关系及潜在神经保护作用。
- 核心机制
- 在朊病毒病模型中，REST下调与Akt-mTOR信号通路抑制和LRP6-Wnt-β-catenin信号通路部分失活相关，导致REST介导的神经保护丧失。
- 主要证据
- 利用263K感染仓鼠和PrP106-126处理的PCCN，通过免疫印迹和免疫荧光证明REST减少、Akt-mTOR和Wnt-β-catenin信号通路失活；过表达REST可恢复这些通路的磷酸化水平，减轻氧化损伤和线粒体损伤。
- 研究意义
- REST介导的神经元存活信号可作为朊病毒病及相关神经退行性疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测REST表达和分布
评估朊病毒感染条件下REST的水平和亚细胞定位。
通过免疫印迹、免疫组化和免疫荧光检测脑组织及细胞中REST的表达和分布。
评估Akt-mTOR和Wnt-β-catenin信号通路状态
确定REST下调是否伴随相关信号通路的改变。
通过免疫印迹分析总蛋白和磷酸化蛋白水平，包括Akt、mTOR、β-catenin、GSK3β等。
过表达或敲低REST验证功能
验证REST对PrP106-126诱导的神经元损伤和信号通路失活的保护作用。
在PCCN中转染REST表达载体或shRNA，处理PrP106-126后检测细胞活力、ROS水平、线粒体形态以及信号通路蛋白磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物感染 | 263K朊病毒株 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Hyclone | -- |
| B27添加剂 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma | -- | |
| 阿糖胞苷 | Sigma | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | 木瓜蛋白酶 | Invitrogen | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 免疫印迹 | 蛋白质印迹 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | ISEQ00010 | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| ECF试剂 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗原修复试剂盒 | Boster | AR0022 |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | -- |
| 细胞活力 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| 线粒体形态 | MitoTracker Green FM探针 | Invitrogen | M7514 |
| 透射电镜 | JEM-2100透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| Leica Ultracut UCT超薄切片机 | Leica | -- | |
| 显微镜观察 | 奥林巴斯BX51显微镜 | Olympus | -- |
| 正置荧光共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 统计 | SPSS软件 | SPSS Inc. | -- |
| GraphPad Prism 5软件 | -- | -- | |
| Image J软件 | National Institutes of Health | -- | |
| 抗体 | 抗REST抗体 | Millipore | 07-579 |
| 抗LRP6抗体 | Cell Signaling Technology | #2560 | |
| 抗p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | #2708T | |
| 抗磷酸化p70 S6激酶(Thr389)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | #9644T | |
| 抗磷酸化4E-BP1(Thr37/46)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化Akt(Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗PRAS40抗体 | Cell Signaling Technology | #2691T | |
| 抗磷酸化PRAS40(Thr246)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化mTOR(Ser2448)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化GSK-3β(Ser9)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化β-连环蛋白(Ser552)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化β-连环蛋白(Ser33/37)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗CREB抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化CREB(Ser133)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | #5324T | |
| 抗磷酸化eIF2α(Ser51)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | #2367 | |
| 抗REST抗体 | Proteintech | 22242-1-AP | |
| 抗LC3-II抗体 | Proteintech | 66139-1-lg | |
| 抗突触素抗体 | Proteintech | 17785-1-AP | |
| 抗PSD-95抗体 | Proteintech | 20665-1-AP | |
| 抗Akt抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 抗β-连环蛋白抗体 | Proteintech | 51067-2-AP | |
| 抗GSK3β抗体 | Proteintech | 22104-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-lg | |
| 抗Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗大鼠β-肌动蛋白抗体 | Bioworld | AP0060 | |
| 山羊抗兔IgG(H&L)-HRP二抗 | Bioworld | BS13278 | |
| 山羊抗小鼠IgG(H&L)-HRP二抗 | Bioworld | -- | |
| TRITC标记的兔抗山羊IgG(H+L) | ZSGB | ZF-0317 | |
| Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG(H+L) | ZSGB | ZF-0516 | |
| 过氧化物酶标记的亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L) | ZSGB | ZB-2301 | |
| 兔抗山羊IgG(H+L) | ZSGB | ZB-2306 | |
| 驴抗兔IgG/FITC | Biosynthesis | bs-0295D-FITC | |
| 驴抗山羊IgG/Cy3 | Biosynthesis | bs-0294D-Cy3 | |
| 神经元III类β-微管蛋白(Tuj1)抗体 | Beyotime | AT809 | |
| 碘化丙啶 | Beyotime | -- | |
| 细胞培养 | 星形孢菌素 | -- | -- |
| 细胞处理 | PrP106-126肽 | Sangon Bio-Tech | -- |
| FITC标记的PrP106-126肽 | Fanbo Biochemicals | -- | |
| 转染 | pCMV-HA-Rest载体 | GeneShare Technology | PPL50007-2a |
| 敲低 | pGPH1/GFP/Neo-REST-Rat shRNA | GenePharma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染模型 | 感染途径：腹腔注射；感染剂量：75 μl 10%脑匀浆；动物品系：5周龄叙利亚金黄仓鼠；分组：正常对照组和263K感染组，每组15只。 阅读提示：Methods: Animal Model of Prion Diseases |
| 细胞培养和肽处理 | 神经元来源：出生后1天的Sprague-Dawley大鼠皮层；培养条件：DMEM/F12含2% B27和0.5%青霉素-链霉素；肽处理浓度：200 μM或300 μM；处理时间：3-60 h；阴性对照：PBS。 阅读提示：Methods: Primary Cultured Cortical Neurons (PCCN) and Prion Protein Peptide |
| REST过表达和敲低 | 转染试剂：Lipofectamine 2000；质粒和试剂用量：2 μg质粒和3 μl转染试剂每12孔板；转染时间：48 h；过表达载体：pCMV-HA-Rest；敲低载体：pGPH1/GFP/Neo-REST-Rat shRNA（shREST-1或shREST-2）。 阅读提示：Methods: Plasmids and Transfection |
| 信号通路检测 | 检测蛋白包括总蛋白和磷酸化蛋白，如p-Akt (Ser473)、p-mTOR (Ser2448)、p-β-catenin (Ser552)等；体内样本：脑组织；体外样本：PCCN裂解液。 阅读提示：Methods: Western Blotting |
| 统计设计 | 所有实验重复三次；数据以均值±SD表示；使用Student's t检验或单因素方差分析，后进行Tukey多重比较；统计软件：SPSS 13.0、GraphPad Prism 5。 阅读提示：Methods: Statistical Analysis |