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        MARCH2通过促进CFTR泛素化和降解以及PIK3CA-AKT-MTOR信号调控自噬

        MARCH2 regulates autophagy by promoting CFTR ubiquitination and degradation and PIK3CA-AKT-MTOR signaling.

        作者信息Dan Xia, Liujing Qu, Ge Li, Beiqi Hongdu, Chentong Xu, Xin Lin, Yaxin Lou, Qihua He, Dalong Ma, Yingyu Chen
        PMID27308891
        期刊Autophagy
        发布时间2016-09
        DOI10.1080/15548627.2016.1192752
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外细胞实验（HeLa、U2OS、HCT116等）、体内裸鼠移植瘤模型，以及分子机制验证（免疫共沉淀、GST pull-down、泛素化实验、信号通路分析）。

        主要模型

        HeLa细胞 U2OS细胞 HCT116细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型

        重点核对

        MARCH2表达水平（过表达或敲低/敲除）对自噬标志物LC3B-II的影响 BafA1处理对LC3B-II积累的影响，以区分自噬体形成与降解 siMARCH2或MARCH2 KO对PIK3CA-AKT-MTOR通路磷酸化水平的影响 MARCH2与CFTR的相互作用对CFTR蛋白稳定性和泛素化的影响 体内实验中MARCH2 KO对肿瘤生长的影响

        摘要

        MARCH2（膜相关RING-CH蛋白2）是一种E3泛素连接酶，主要与囊泡运输相关。在本研究中，我们首次证明了MARCH2负向调控自噬。我们的数据表明，MARCH2过表达损害自噬，表现为LC3B-II水平降低以及内源性和外源性自噬底物的降解受损。相反，MARCH2表达缺失则产生相反的效果。体内实验表明，MARCH2敲除介导的自噬导致肿瘤形成能力受到抑制。进一步研究发现，MARCH2缺失诱导的自噬是通过PIK3CA-AKT-MTOR信号通路介导的。此外，我们发现MARCH2与CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节因子）相互作用，促进CFTR的泛素化和降解，并抑制肿瘤细胞中CFTR介导的自噬。MARCH2的功能性PDZ结构域是与CFTR结合所必需的。因此，我们的研究确定了一个新的自噬负调控因子，并提示在不同条件下MARCH2与CFTR之间的物理和功能联系将在进一步的实验中得到阐明。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        MARCH2是否以及如何调控自噬？
        核心机制
        MARCH2通过促进CFTR的泛素化和降解，并抑制PIK3CA-AKT-MTOR信号通路，从而负向调控自噬。
        主要证据
        在HeLa、U2OS、HCT116等细胞中，MARCH2过表达减少LC3B-II和自噬底物降解，敲低或敲除则相反；免疫共沉淀和GST pull-down显示MARCH2通过PDZ结构域与CFTR结合并促进其泛素化和降解；MARCH2敲低降低PIK3CA-AKT-MTOR信号；裸鼠移植瘤实验显示MARCH2 KO抑制肿瘤生长。
        研究意义
        本研究首次鉴定MARCH2为自噬的负调控因子，提示其可能作为肿瘤治疗的潜在靶点，并为进一步阐明MARCH2与CFTR在不同条件下的物理和功能联系提供基础。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        验证MARCH2对自噬的影响

        确定MARCH2表达水平对自噬的影响

        在HeLa和U2OS细胞中过表达或敲低MARCH2，通过Western blot检测LC3B-II水平、GFP-LC3B点状聚集、自噬底物降解等。

        2

        验证MARCH2对自噬流的影响

        评估MARCH2对自噬体形成和降解的影响

        使用透射电镜观察自噬体结构，使用GFP-LC3B、mTagRFP-mWasabi-LC3B等探针检测自噬流。

        3

        鉴定MARCH2调控自噬的上游信号

        探究MARCH2调控自噬的分子机制

        沉默ATG7、ATG5、ATG16L1、BECN1、PIK3C3、ULK1等，检测LC3B-II水平变化。

        4

        验证PIK3CA-AKT-MTOR信号通路

        验证MARCH2是否通过PIK3CA-AKT-MTOR通路调控自噬

        检测MARCH2敲低或过表达后PIK3CA、AKT、MTOR及其下游分子的磷酸化水平，并使用RHEB突变体进行回复实验。

        5

        验证MARCH2与CFTR的相互作用

        确认MARCH2与CFTR的结合及其对CFTR稳定性的影响

        通过免疫共沉淀和GST pull-down验证MARCH2与CFTR的相互作用，检测MARCH2对CFTR泛素化和降解的影响。

        6

        验证CFTR在自噬中的作用

        探究CFTR对自噬的调控作用

        在肿瘤细胞中过表达或敲低CFTR，检测LC3B-II水平、自噬底物降解等。

        7

        体内验证MARCH2敲除对肿瘤生长的影响

        在动物模型中验证MARCH2敲除对肿瘤形成的影响

        将对照和MARCH2敲除的HCT116细胞皮下注射到裸鼠，观察肿瘤生长情况。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹法反转录聚合酶链反应
        验证细胞功能变化
        共聚焦显微镜透射电子显微镜流式细胞术
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹法免疫荧光
        验证免疫效应
        裸鼠肿瘤形成实验
        验证机制链路
        免疫共沉淀GST沉降实验泛素化检测
        评估体内效果
        异种移植瘤模型
        数据分析与统计
        学生t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        免疫印迹兔多克隆抗MARCH2抗体AbcamAB76397
        抗LC3B抗体Sigma-AldrichL7543
        抗CFTR抗体Santa Cruz Biotechnologysc-8909
        抗β-肌动蛋白抗体Tianjin SungeneKM9001
        抗GST抗体Tianjin SungeneKM8005
        抗FLAG抗体Tianjin SungeneKM8002L
        抗HA抗体Tianjin SungeneKM8004
        抗GFP抗体Tianjin SungeneKM8009L
        抗组织蛋白酶B抗体AbcamAB33538
        抗组织蛋白酶D抗体AbcamAB6313
        抗ATG16L1抗体MBLPM040
        抗BECN1抗体MBLPD017
        抗SQSTM1/p62抗体Cell Signaling Technology5114
        抗泛素抗体Cell Signaling Technology3936
        抗ATG5抗体Cell Signaling Technology12994S
        抗MTOR抗体Cell Signaling Technology2983S
        抗磷酸化MTOR（Ser2448）抗体Cell Signaling Technology2971S
        抗RPS6KB1抗体Cell Signaling Technology2708S
        抗磷酸化RPS6KB1（Thr389）抗体Cell Signaling Technology9234S
        抗RPS6抗体Cell Signaling Technology2217S
        抗磷酸化RPS6（Ser235/236）抗体Cell Signaling Technology4858S
        抗PIK3R1/p85抗体Cell Signaling Technology4292
        抗磷酸化PIK3R1/p85（Tyr458）抗体Cell Signaling Technology4228S
        抗AKT抗体Cell Signaling Technology9272S
        抗磷酸化AKT（Ser473）抗体Cell Signaling Technology4060S
        抗磷酸化EIF4EBP1（Thr37/46）抗体Cell Signaling Technology2855S
        抗磷酸化TSC2（Thr1462）抗体Cell Signaling Technology3617S
        抗MAPK1/p42-MAPK3/p44抗体Cell Signaling Technology4695S
        抗磷酸化MAPK1/p42-MAPK3/p44（Thr202/Tyr204）抗体Cell Signaling Technology4370S
        抗MAPK9/JNK2抗体Cell Signaling Technology9258S
        抗磷酸化SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）抗体Cell Signaling Technology9255S
        抗MAPK11-MAPK12-MAPK14抗体Cell Signaling Technology8690S
        抗磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）抗体Cell Signaling Technology4511S
        抗AMPKα1/α2抗体Cell Signaling Technology2532S
        抗磷酸化AMPKα1/α2（Thr172）抗体Cell Signaling Technology2535S
        DyLight 800/DyLight 680偶联IgG二抗Rockland610-145-002/610-144-002/611-145-002/611-144-002
        免疫荧光FITC/RBITC偶联IgG二抗Bioss Inc.bs-0296G-FITC/bs-0296G-RBITC/bs-0295G-FITC/bs-0295G-RBITC
        荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告系统PromegaE1910
        细胞处理巴弗洛霉素A1Sigma-AldrichB1793
        DQ-牛血清白蛋白Life TechnologiesD12051
        3-甲基腺嘌呤Sigma-AldrichM9281
        渥曼青霉素Sigma-AldrichW1628
        LY294002Cayman Chemical70920
        E64dENZO Life SciencesALX-260-007-M005
        胃蛋白酶抑制剂ASigma-AldrichP5318-5MG
        MG132Sigma-AldrichC2211
        雷帕霉素Sigma-AldrichR117
        细胞培养DMEM培养基Invitrogen12800-017
        转染MegaTran 1.0转染试剂OriGeneTT200004
        Lipofectamine 2000转染试剂Life Technologies11668-019
        裂解液RIPA裂解液BeyotimeP0013D
        免疫沉淀免疫沉淀裂解液----
        蛋白酶抑制剂Roche Diagnostics04693116001
        蛋白G琼脂糖凝胶GE Healthcare17-0618-01
        GST pull-down谷胱甘肽琼脂糖凝胶4BGE Healthcare17-0756-01
        体外翻译RTS 100小麦胚芽CECF试剂盒biotechrabbit GmbH2402100
        荧光素酶检测96孔检测板COSTAR, Corning Inc.3925

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养和处理
        细胞系（HeLa、U2OS、A549、HCT116、293T），培养基（DMEM+10%FBS），转染试剂（MegaTran 1.0和Lipofectamine 2000），药物处理（BafA1 10 nM，RAPA 5 μM，3-MA 10 mM，wortmannin 10 μM，LY294002 10 μM，E64d和pepstatin A，CHX 100 μg/ml，MG132），时间（6小时、24小时、48小时等）
        阅读提示：Materials and methods: Cell culture, transfections and treatments
        自噬检测
        LC3B-II水平，GFP-LC3B puncta计数，TEM自噬体结构，自噬底物（SQSTM1、polyQ80）降解
        阅读提示：Results: 图1、图2；Materials and methods: Immunofluorescence, transmission electron microscopy, polyQ degradation assay
        信号通路分析
        MARCH2敲低或过表达后PIK3CA-AKT-MTOR通路蛋白磷酸化水平（PIK3R1 Tyr458，AKT Ser473，TSC2 Thr1462，MTOR Ser2448，RPS6KB1 Thr389，RPS6 Ser235/236，EIF4EBP1 Thr37/46）
        阅读提示：Results: 图4；Materials and methods: 免疫印迹部分
        蛋白互作和泛素化
        MARCH2与CFTR的相互作用（IP和GST pull-down），MARCH2对CFTR泛素化水平和稳定性的影响（CHX追踪、泛素化实验）
        阅读提示：Results: 图5、图7；Materials and methods: Immunoprecipitation and western blot analysis, GST affinity isolation assay
        动物实验
        BALB/c裸鼠（6-8周龄，雌性），HCT116细胞（对照和MARCH2 KO），皮下注射细胞数（4×10^6），肿瘤观察时间（20天）
        阅读提示：Results: 图S11；Materials and methods: Tumorigenicity in nude mice

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