单细胞RNA测序揭示鼓室颈静脉副神经节瘤微环境中成纤维细胞的异质性

Single-cell RNA-Seq reveals the heterogeneity of fibroblasts within the tympanojugular paraganglioma microenvironment.

作者信息Shengming Wang, Boya Zhang, Zihan Lou, Yibing Hu, Jian Wang, Jingjing Wang, Zhengnong Chen, Shankai Yin
PMID39170307
期刊Heliyon
发布时间2024-07-31
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e35478

实验完整度

包含scRNA-seq、WES、mIHC等明确实验方法和验证结果,但缺乏动物模型或体外功能实验,证据层级有限

主要模型

六例TJP手术切除样本 TJP组织成纤维细胞

重点核对

scRNA-seq样本数:6例TJP 细胞过滤标准:UMI<500或基因数<200或线粒体UMI>25%排除 聚类分辨率:0.8 mIHC验证:CD34, S100B, TAGLN等标记 细胞通讯分析工具:CellChat (v1.6.0)

摘要

鼓室颈静脉副神经节瘤(TJP)起源于颅底外侧的副交感神经节。尽管副神经节瘤的细胞组成和致癌机制已被评估,但针对TJP的全面的转录组图谱仍有待建立以促进进一步研究。在本研究中,对六例手术切除的TJP样本进行了单细胞RNA测序和全外显子组测序,以确定其细胞组成和瘤内异质性。成纤维细胞被细分为两个不同的群体:肌成纤维细胞和与骨重塑相关的成纤维细胞。此外,确定了一个精细的调控和细胞间通讯网络,突出了成纤维细胞的多方面作用,该作用随表达转变而变化。Kit受体(KIT)信号通路介导了成纤维细胞与肥大细胞之间的相互作用,而通过血小板衍生生长因子信号通路促进了与内皮细胞和施万细胞样细胞的强烈连接。这些发现为研究促肿瘤血管生成的机制以及成纤维细胞在TJP微环境中的特定贡献奠定了基础。成纤维细胞与巨噬细胞和内皮细胞相互作用的IL6信号通路可能参与肿瘤再生长。这些结果增强了我们对成纤维细胞功能的理解,并为未来TJP的靶向治疗提供了资源。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
TJP微环境中细胞组成及成纤维细胞的异质性和功能角色是什么?
核心机制
成纤维细胞通过KIT信号通路与肥大细胞相互作用,通过PDGF信号通路与内皮细胞和施万细胞样细胞连接;成纤维细胞的IL6信号通路与巨噬细胞和内皮细胞相互作用可能参与肿瘤再生长。
主要证据
基于六例TJP样本的scRNA-seq分析,结合mIHC验证KIT和PDGF通路,并通过复发组与原发组比较发现IL6通路富集。
研究意义
建立TJP转录组图谱,为理解成纤维细胞在TJP微环境中的作用及未来治疗策略提供基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本收集与处理

获取TJP肿瘤样本进行多组学分析。

六例病理确诊TJP患者,手术切除样本,一半用于scRNA-seq,另一半用于mIHC和全外显子测序。患者术前24-48小时接受颈内动脉支架植入,未接受抗肿瘤治疗。

2

单细胞转录组测序

解析TJP的细胞组成和转录组特征。

使用BD Rhapsody平台进行单细胞捕获,构建cDNA文库并测序。原始数据经过BD Pipeline处理,使用Seurat进行降维聚类,识别主要细胞类型。

3

成纤维细胞亚型分析

揭示成纤维细胞的异质性和亚群特征。

从整体数据中分离成纤维细胞进行重聚类,获得九个亚群,根据标志基因和富集分析分为肌成纤维细胞和骨重塑相关成纤维细胞。

4

拟时序分析

探索成纤维细胞的分化轨迹和功能转变。

使用Monocle3进行拟时序分析,识别出两条主要轨迹,对应肌成纤维细胞和骨重塑相关成纤维细胞,并分析基因表达变化。

5

转录因子调控网络分析

识别调控成纤维细胞亚群的关键转录因子。

使用SCENIC分析,识别各亚群的高活性调控子,如EBF1, TEAD3, NR2F2等,并比较不同亚群间的调控差异。

6

细胞间通讯分析

揭示成纤维细胞与其他细胞类型的相互作用网络。

使用CellChat分析配体-受体相互作用,发现KIT, GRN, PDGF等通路,并通过mIHC验证KIT和PDGF通路。

7

复发与原发样本比较

探究与肿瘤再生长相关的信号通路。

比较复发组(1例)与原发组(5例)的细胞通讯差异,发现IL6等通路富集,并确认IL6在成纤维细胞中高表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
BD Rhapsody 芯片BD Biosciences--
BD Rhapsody 扫描仪BD Biosciences--
BD Rhapsody cDNA试剂盒BD Biosciences633773
BD Rhapsody 靶向mRNA & AbSeq扩增试剂盒BD Biosciences633801
NovaSeq平台Illumina--
QIAamp DNA FFPE组织试剂盒Magen BiotechnologyD6323-02B
Rapid CE DNA文库制备试剂盒Illumina V2ABclonalRK20254
xGen外显子组研究探针panel v 2.0Integrated DNA Technologies--
AMPure XP系统Beckman Coulter--
2100生物分析仪Agilent Technologies--
7色IHC试剂盒Absinbioabs50015-100T
DAPIThermo Fisher ScientificD1306
Aperio Versa 8组织成像系统Leica--
S100 beta多克隆抗体Proteintech15146-1-AP
transgelin/SM22多克隆抗体Proteintech10493-1-AP
PDAP1多克隆抗体Proteintech15081-1-AP
Sortilin多克隆抗体Proteintech12369-1-AP
APOD单克隆抗体Proteintech66215-1-Ig
CD34兔多克隆抗体ABclonalA0761
SMMHC/MYH11兔单克隆抗体ABclonalA4064
CD117/c-Kit兔多克隆抗体ABclonalA0357
KITLG兔多克隆抗体ABclonalA16245
TPSAB1兔多克隆抗体ABclonalA2022
PDGFRB兔多克隆抗体ABclonalA1444
颗粒蛋白前体兔多克隆抗体ABclonalA12440
突触素-1兔单克隆抗体ABclonalA24122
PDGFRA抗体Signalway Antibody38364
抗α-SMA抗体BOSTERBM0002
抗lumina抗体Abcamab168348
Cy3标记山羊抗兔IgGServicebioGB21303
Cy3标记山羊抗小鼠IgGServicebioGB21301
Cy3标记山羊抗大鼠IgGServicebioGB21302
Cy3标记驴抗山羊IgGServicebioGB21404
Cy3标记驴抗小鼠IgGServicebioGB21401
Cy3标记驴抗兔IgGServicebioGB21403
Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgGServicebioGB25303
Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgGServicebioGB25301
Cy5标记山羊抗小鼠IgGServicebioGB27301
Cy5标记山羊抗兔IgGServicebioGB27303
HRP标记兔抗山羊IgGServicebioGB23204
HRP标记山羊抗小鼠IgGServicebioGB23301
HRP标记山羊抗大鼠IgGServicebioGB23302
HRP标记山羊抗兔IgGServicebioGB23303
HRP标记驴抗山羊IgGServicebioGB23404
FITC标记驴抗山羊IgGServicebioGB22404
FITC标记山羊抗大鼠IgGServicebioGB22302
FITC标记驴抗兔IgGServicebioGB22403
FITC标记驴抗小鼠IgGServicebioGB22401
FITC-酪酰胺ServicebioG1222
CY3-酪酰胺ServicebioG1223
iF488-酪酰胺ServicebioG1231
iF647-酪酰胺ServicebioG1232
Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgGJackson Laboratories111-585-003
Alexa Fluor 594标记山羊抗小鼠IgGJackson Laboratories115-585-003
钙黄绿素AM----
Draq7----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
单细胞转录组测序
样本处理:肿瘤组织用Solo™ Tumor Dissociation Kit在37°C消化30-60分钟;细胞过滤网:40 μm;染色:Calcein AM和Draq7;捕获平台:BD Rhapsody;文库构建试剂盒:BD Rhapsody cDNA Kit和Targeted mRNA & AbSeq Amplification Kit;测序模式:PE150;数据过滤:UMI<500, 基因<200, 线粒体>25%排除
阅读提示:Methods 2.2, 2.3, 2.5
全外显子组测序
样本:FFPE组织切片,厚度3μm×10片;DNA提取:QIAamp DNA FFPE Tissue Kit;片段化:180-280bp;文库构建:Rapid CE DNA Lib Prep Kit Illumina V2;捕获:xGen Exome Research Panel v 2.0;测序深度:900×
阅读提示:Methods 2.12
mIHC
切片厚度:4μm;抗体孵育:一抗30分钟,二抗10分钟;信号放大:TSA 520;抗原修复:90°C柠檬酸溶液,微波20%功率15分钟;细胞核染色:DAPI;成像系统:Aperio Versa 8;分析软件:QuPath v0.5.0
阅读提示:Methods 2.13, 2.14
单细胞数据分析
使用Seurat (v4.0.0), Harmony (v1.0), SingleR (v1.4.1), ClusterProfiler (v4.0.5), Monocle3 (v1.0.0), SCENIC (v1.2.2), CellChat (v1.6.0);聚类分辨率:0.8;主成分数:30
阅读提示:Methods 2.5-2.11