样本收集与处理
获取TJP肿瘤样本进行多组学分析。
六例病理确诊TJP患者,手术切除样本,一半用于scRNA-seq,另一半用于mIHC和全外显子测序。患者术前24-48小时接受颈内动脉支架植入,未接受抗肿瘤治疗。
Single-cell RNA-Seq reveals the heterogeneity of fibroblasts within the tympanojugular paraganglioma microenvironment.
包含scRNA-seq、WES、mIHC等明确实验方法和验证结果,但缺乏动物模型或体外功能实验,证据层级有限
六例TJP手术切除样本 TJP组织成纤维细胞
scRNA-seq样本数:6例TJP 细胞过滤标准:UMI<500或基因数<200或线粒体UMI>25%排除 聚类分辨率:0.8 mIHC验证:CD34, S100B, TAGLN等标记 细胞通讯分析工具:CellChat (v1.6.0)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取TJP肿瘤样本进行多组学分析。
六例病理确诊TJP患者,手术切除样本,一半用于scRNA-seq,另一半用于mIHC和全外显子测序。患者术前24-48小时接受颈内动脉支架植入,未接受抗肿瘤治疗。
解析TJP的细胞组成和转录组特征。
使用BD Rhapsody平台进行单细胞捕获,构建cDNA文库并测序。原始数据经过BD Pipeline处理,使用Seurat进行降维聚类,识别主要细胞类型。
揭示成纤维细胞的异质性和亚群特征。
从整体数据中分离成纤维细胞进行重聚类,获得九个亚群,根据标志基因和富集分析分为肌成纤维细胞和骨重塑相关成纤维细胞。
探索成纤维细胞的分化轨迹和功能转变。
使用Monocle3进行拟时序分析,识别出两条主要轨迹,对应肌成纤维细胞和骨重塑相关成纤维细胞,并分析基因表达变化。
识别调控成纤维细胞亚群的关键转录因子。
使用SCENIC分析,识别各亚群的高活性调控子,如EBF1, TEAD3, NR2F2等,并比较不同亚群间的调控差异。
揭示成纤维细胞与其他细胞类型的相互作用网络。
使用CellChat分析配体-受体相互作用,发现KIT, GRN, PDGF等通路,并通过mIHC验证KIT和PDGF通路。
探究与肿瘤再生长相关的信号通路。
比较复发组(1例)与原发组(5例)的细胞通讯差异,发现IL6等通路富集,并确认IL6在成纤维细胞中高表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞转录组测序 | BD Rhapsody 芯片 | BD Biosciences | -- |
| BD Rhapsody 扫描仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD Rhapsody cDNA试剂盒 | BD Biosciences | 633773 | |
| BD Rhapsody 靶向mRNA & AbSeq扩增试剂盒 | BD Biosciences | 633801 | |
| NovaSeq平台 | Illumina | -- | |
| 全外显子组测序 | QIAamp DNA FFPE组织试剂盒 | Magen Biotechnology | D6323-02B |
| Rapid CE DNA文库制备试剂盒Illumina V2 | ABclonal | RK20254 | |
| xGen外显子组研究探针panel v 2.0 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| AMPure XP系统 | Beckman Coulter | -- | |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| mIHC | 7色IHC试剂盒 | Absinbio | abs50015-100T |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aperio Versa 8组织成像系统 | Leica | -- | |
| S100 beta多克隆抗体 | Proteintech | 15146-1-AP | |
| transgelin/SM22多克隆抗体 | Proteintech | 10493-1-AP | |
| PDAP1多克隆抗体 | Proteintech | 15081-1-AP | |
| Sortilin多克隆抗体 | Proteintech | 12369-1-AP | |
| APOD单克隆抗体 | Proteintech | 66215-1-Ig | |
| CD34兔多克隆抗体 | ABclonal | A0761 | |
| SMMHC/MYH11兔单克隆抗体 | ABclonal | A4064 | |
| CD117/c-Kit兔多克隆抗体 | ABclonal | A0357 | |
| KITLG兔多克隆抗体 | ABclonal | A16245 | |
| TPSAB1兔多克隆抗体 | ABclonal | A2022 | |
| PDGFRB兔多克隆抗体 | ABclonal | A1444 | |
| 颗粒蛋白前体兔多克隆抗体 | ABclonal | A12440 | |
| 突触素-1兔单克隆抗体 | ABclonal | A24122 | |
| PDGFRA抗体 | Signalway Antibody | 38364 | |
| 抗α-SMA抗体 | BOSTER | BM0002 | |
| 抗lumina抗体 | Abcam | ab168348 | |
| Cy3标记山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | |
| Cy3标记山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB21301 | |
| Cy3标记山羊抗大鼠IgG | Servicebio | GB21302 | |
| Cy3标记驴抗山羊IgG | Servicebio | GB21404 | |
| Cy3标记驴抗小鼠IgG | Servicebio | GB21401 | |
| Cy3标记驴抗兔IgG | Servicebio | GB21403 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG | Servicebio | GB25303 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB25301 | |
| Cy5标记山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB27301 | |
| Cy5标记山羊抗兔IgG | Servicebio | GB27303 | |
| HRP标记兔抗山羊IgG | Servicebio | GB23204 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB23301 | |
| HRP标记山羊抗大鼠IgG | Servicebio | GB23302 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Servicebio | GB23303 | |
| HRP标记驴抗山羊IgG | Servicebio | GB23404 | |
| FITC标记驴抗山羊IgG | Servicebio | GB22404 | |
| FITC标记山羊抗大鼠IgG | Servicebio | GB22302 | |
| FITC标记驴抗兔IgG | Servicebio | GB22403 | |
| FITC标记驴抗小鼠IgG | Servicebio | GB22401 | |
| FITC-酪酰胺 | Servicebio | G1222 | |
| CY3-酪酰胺 | Servicebio | G1223 | |
| iF488-酪酰胺 | Servicebio | G1231 | |
| iF647-酪酰胺 | Servicebio | G1232 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG | Jackson Laboratories | 111-585-003 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗小鼠IgG | Jackson Laboratories | 115-585-003 | |
| 单细胞转录组测序 | 钙黄绿素AM | -- | -- |
| Draq7 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞转录组测序 | 样本处理:肿瘤组织用Solo™ Tumor Dissociation Kit在37°C消化30-60分钟;细胞过滤网:40 μm;染色:Calcein AM和Draq7;捕获平台:BD Rhapsody;文库构建试剂盒:BD Rhapsody cDNA Kit和Targeted mRNA & AbSeq Amplification Kit;测序模式:PE150;数据过滤:UMI<500, 基因<200, 线粒体>25%排除 阅读提示:Methods 2.2, 2.3, 2.5 |
| 全外显子组测序 | 样本:FFPE组织切片,厚度3μm×10片;DNA提取:QIAamp DNA FFPE Tissue Kit;片段化:180-280bp;文库构建:Rapid CE DNA Lib Prep Kit Illumina V2;捕获:xGen Exome Research Panel v 2.0;测序深度:900× 阅读提示:Methods 2.12 |
| mIHC | 切片厚度:4μm;抗体孵育:一抗30分钟,二抗10分钟;信号放大:TSA 520;抗原修复:90°C柠檬酸溶液,微波20%功率15分钟;细胞核染色:DAPI;成像系统:Aperio Versa 8;分析软件:QuPath v0.5.0 阅读提示:Methods 2.13, 2.14 |
| 单细胞数据分析 | 使用Seurat (v4.0.0), Harmony (v1.0), SingleR (v1.4.1), ClusterProfiler (v4.0.5), Monocle3 (v1.0.0), SCENIC (v1.2.2), CellChat (v1.6.0);聚类分辨率:0.8;主成分数:30 阅读提示:Methods 2.5-2.11 |