临床样本分析与相关性研究
探讨 PDGF-BB 在胆管癌组织中的表达水平及其与淋巴结转移和患者预后的关系。
收集 126 例胆管癌患者肿瘤组织，通过 IHC、免疫荧光、ELISA 检测 PDGF-BB 表达，分析其与淋巴结状态和总生存期的相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
癌症相关成纤维细胞通过PDGF-BB/PDGFR-β介导的旁分泌信号网络促进胆管癌淋巴转移
Cancer-Associated Fibroblasts Promote Lymphatic Metastasis in Cholangiocarcinoma via the PDGF-BB/PDGFR-β Mediated Paracrine Signaling Network.
实验完整度
高包含临床样本分析、体外细胞功能实验、体内动物模型及基因敲除和抑制剂验证，多层级证据支持机制结论。
主要模型
胆管癌细胞系 QBC939 和 HuCCT1 原代癌症相关成纤维细胞（CAFs） 淋巴内皮细胞（HLECs） BALB/c 裸鼠皮下移植瘤及腘窝淋巴结转移模型
重点核对
CAFs 的 LN+ 和 LN- 状态及其 PDGF-BB 分泌水平 PDGFB 基因敲除 CAFs（CAFPDGFB(KO)）的验证 PDGF-BB 阻断抗体（50 μg/kg）和 PDGFR 抑制剂 STI571（50 mg/kg）的剂量及给药方式 GSK 抑制剂 CHIR-98014（20 mg/kg）和 P65 抑制剂 PG490（1 mg/kg）的剂量及给药方式 细胞共注射比例（肿瘤细胞 5×10^6，CAFs 5×10^5）
摘要
伴有淋巴结转移（LNM）的胆管癌（CCA）患者即使在完全切除后预后也最差；然而，其潜在机制仍不清楚。在此，我们确定了CAF来源的PDGF-BB是CCA中LMN（应为LNM）的调节因子。蛋白质组学分析显示，来自伴有LNM的CCA患者（LN+CAFs）的CAFs中PDGF-BB上调。临床上，CAF-PDGF-BB的表达与CCA患者的不良预后和LNM增加相关，而CAF分泌的PDGF-BB增强了淋巴内皮细胞（LEC）介导的淋巴管生成，并促进了肿瘤细胞的跨LEC迁移能力。将LN+CAFs和癌细胞共注射可增加体内肿瘤生长和LNM。机制上，CAF来源的PDGF-BB激活了LECs中其受体PDGFR-β及其下游ERK1/2-JNK信号通路以促进淋巴管生成，同时它也上调了PDGFR-β-GSK-P65介导的肿瘤细胞迁移。最后，靶向PDGF-BB/PDGFR-β或GSK-P65信号轴在体内抑制了CAF介导的腘窝淋巴结转移（PLM）。总之，我们的发现揭示了CAFs通过旁分泌网络促进肿瘤生长和LNM，为晚期CCA患者确定了一个有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAF 来源的 PDGF-BB 是否以及在何种机制下促进胆管癌的淋巴管生成和淋巴结转移？
- 核心机制
- CAF 分泌的 PDGF-BB 通过激活淋巴内皮细胞中 PDGFR-β 下游的 ERK1/2-JNK 信号通路促进淋巴管生成，并通过激活肿瘤细胞中 PDGFR-β 下游的 GSK3β-P65 信号通路增强肿瘤细胞迁移和跨内皮迁移能力。
- 主要证据
- 临床样本显示 PDGF-BB 高表达与淋巴结转移和不良预后相关；体外实验显示 PDGF-BB 促进 LEC 管形成和肿瘤细胞迁移；体内 PLM 模型证实 PDGFB 敲除或靶向 PDGF-BB/PDGFR-β 可抑制淋巴转移。
- 研究意义
- 该研究为晚期胆管癌提供了潜在的治疗靶点，即靶向 PDGF-BB/PDGFR-β 信号轴及其下游通路，并提示 STI571 可能重新用于胆管癌治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CAFs 分离与功能验证
验证 CAFs 中 PDGF-BB 的表达是否高于正常成纤维细胞，并评估 LN+CAFs 对肿瘤细胞恶性行为的影响。
从 CCA 组织和癌旁组织分离原代 CAFs 和 NFs，通过 ELISA 和 Western blot 检测 PDGF-BB 分泌；用 LN+CAFs 和 LN-CAFs 的条件培养基处理肿瘤细胞，进行迁移、侵袭、跨内皮迁移、克隆形成和增殖实验。
体外淋巴管生成实验
评估 CAFs 分泌的 PDGF-BB 对淋巴内皮细胞迁移和管形成的影响。
用 LN+CAFs、LN-CAFs 和 CAFPDGFB(KO) 的条件培养基处理 HLECs，进行 Transwell 迁移和管形成实验。
体内肿瘤生长和淋巴转移实验
验证 CAFs 及其分泌的 PDGF-BB 在体内对肿瘤生长和淋巴结转移的影响。
将 QBC939 或 HuCCT1 细胞单独或与 LN+CAFs、LN-CAFs、CAFPDGFB(KO) 共注射到裸鼠皮下或脚垫，监测肿瘤生长和腘窝淋巴结转移；用 PDGF-BB 抗体、STI571、CHIR-98014、PG490 处理。
机制通路研究
探索 PDGF-BB 在肿瘤细胞和淋巴内皮细胞中激活的下游信号通路。
用 PDGF-BB 或 CAF 条件培养基处理肿瘤细胞和 HLECs，Western blot 检测 GSK3β、P65、JNK、ERK1/2 等磷酸化水平；使用抑制剂验证通路特异性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | α-SMA 抗体 | Servicebio | GB13044 |
| PDGF-BB 抗体 | ThermoFisher | PA588272 | |
| Podoplanin 抗体 | Novus | NBP1-90211 | |
| LYVE1 抗体 | Abcam | Ab281587 | |
| PDGFR-β 抗体 | Signalway Antibody | 41327 | |
| PDGFR-α 抗体 | Signalway Antibody | 33470 | |
| p-FAK 抗体 | Signalway Antibody | C90918Bio | |
| FAK 抗体 | Cell Signaling Technology | 3285 | |
| p-AKT 抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| AKT 抗体 | Cell Signaling Technology | 2920 | |
| p-P65 抗体 | Abcam | Ab86299 | |
| P65 抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| p-JNK 抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| JNK 抗体 | Abcam | Ab76125 | |
| p-ERK 抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| ERK 抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| p-GSK 抗体 | Cell Signaling Technology | 9336 | |
| GSK 抗体 | Cell Signaling Technology | 12456 | |
| p-YAP 抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| YAP 抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| Ki-67 抗体 | Servicebio | GB111499 | |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | V900933 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Servicebio | G1012 | |
| Alexa Fluor 偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| 激光共聚焦显微镜 LSM780 | Zeiss | -- | |
| 多重TSA染色 | TSA-AF488 | Invitrogen | B40953 |
| TSA-AF555 | Invitrogen | B40955 | |
| ELISA | PDGF-BB ELISA 试剂盒 | Enzyme linked Biotechnology Co. (MIbio) | ml001574J |
| 蛋白质组学分析 | Pierce™ BCA 蛋白测定试剂盒 | -- | -- |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| Oasis HLB 柱 | Waters | 186000383 | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| BALB/c 裸鼠 | Guangdong Province Experimental Animal Center | -- | |
| IVIS Spectrum 成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| Eclipse 80I 系统和 NIS-Elements 软件 | Nikon | -- | |
| 药物处理 | STI571（伊马替尼） | Selleck | -- |
| PG490（P65 抑制剂） | Applied InvivoChem Inc. | -- | |
| CHIR-98014（GSK 抑制剂） | Applied AOBIOUS Inc. | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本 | 样本量（126例）、来源（中山大学孙逸仙纪念医院）、时间（2012年1月至2018年7月）、纳入标准（病理确诊） 阅读提示：Patients and clinical samples 部分 |
| 细胞培养 | 细胞系（QBC939、HuCCT1、Huh28、HCCC-9810、ZJU-1125）、CAFs 和 NFs 的分离和纯化验证 阅读提示：Results 部分 Expression levels... 中有关细胞系和原代成纤维细胞分离的描述 |
| 体外功能实验 | CAF 条件培养基制备（80% 融合、无血清培养 24 小时）、Transwell 迁移/侵袭、TrEM、克隆形成、MTT 实验的具体参数 阅读提示：Figure 2 和 Figure 3 图注 |
| 淋巴管生成实验 | HLECs 来源、管形成实验和 Transwell 迁移的实验条件 阅读提示：Figure 4 和 Figure 5 图注 |
| 体内动物模型 | 小鼠品系（BALB/c 裸鼠）、年龄（4周）、体重（18-20g）、细胞注射数量、部位（皮下或脚垫）、共注射比例、处理药物剂量和时间 阅读提示：PLM model 和 Subcutaneous tumor models 部分 |
| 药物处理 | anti-PDGF-BB 抗体（50 μg/kg）、STI571（50 mg/kg）、CHIR-98014（20 mg/kg）、PG490（1 mg/kg）的剂量、给药方式（腹腔注射）、频率（每3天） 阅读提示：PLM model 和 Subcutaneous tumor models 部分 |
| 蛋白检测 | 抗体信息（品牌、编号）、蛋白提取和 Western blot 条件 阅读提示：Materials and Methods 中 IHC 部分及 Supplementary Table 2 |