KPNB1-ATF4诱导BNIP3依赖性线粒体自噬促进牙髓干细胞成牙本质向分化

背景：将牙髓干细胞（DPSCs）分化为成牙本质细胞是牙齿自我修复和临床牙本质-牙髓组织工程策略的关键过程。然而，调控DPSC成牙本质向分化的机制在很大程度上仍不清楚。在此，我们证明了BCL-2相互作用蛋白3（BNIP3）依赖性线粒体自噬与导入蛋白亚基β-1（KPNB1）-活化转录因子4（ATF4）相关，可促进DPSC成牙本质向分化。方法：通过生物信息学鉴定参与DPSC成牙本质向分化的关键基因。通过稳定沉默或过表达BNIP3，研究其对体外DPSC分化的影响（n≥3）。为了探究BNIP3在体内的作用，将负载水凝胶转染DPSC复合物的牙根片段植入裸鼠（n≥6）。采用双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）聚合酶链反应（PCR）探究ATF4与BNIP3启动子的结合位点（n≥3）。进行线粒体功能实验，研究ATF4-BNIP3对线粒体的影响（n≥3）。采用免疫沉淀（IP）质谱（MS）研究ATF4与其结合蛋白KPNB1之间的相互作用。构建含有野生型（WT）/突变型（MUT）-核定位信号（NLS）形式的ATF4质粒，以确定KPNB1识别的特定氨基酸残基及其对DPSC成牙本质向分化的影响（n≥3）。结果：与对照组相比，DPSC成牙本质向分化组的自噬和线粒体自噬水平，尤其是BNIP3依赖性线粒体自噬水平更高（P<0.05）。BNIP3的基因沉默或过表达表明，BNIP3表达与DPSC向成牙本质细胞转变在体内外均呈正相关（P<0.05）。ATF4通过直接结合BNIP3启动子区域内约-1292至-1279 bp和约-1185至-1172 bp的区域来调控BNIP3的表达，这与线粒体自噬和线粒体活性氧（mtROS）水平相关（P<0.05）。此外，ATF4通过BNIP3增加线粒体自噬、线粒体功能和细胞分化潜能（P<0.05）。机制上，KPNB1是ATF4的一个新相互作用蛋白，特异性识别ATF4内的氨基酸（aa）280-299，以控制其转位进入细胞核以及随后的转录和分化过程（P<0.05）。结论：我们报道了KPNB1/ATF4/BNIP3轴依赖性线粒体自噬的关键作用，可能为DPSC中牙髓-牙本质复合体的再生提供新的线索。