TAB2对氧化应激的影响
探究TAB2在颗粒细胞氧化应激中的作用
使用H2O2处理GCs诱导氧化应激，检测ROS积累、TAB2表达；过表达或敲低TAB2，检测氧化应激相关基因（CAT、SOD1）和NF-κB通路基因（P50、P65）的表达及ROS水平；并进行RNA-seq分析TAB2敲低后差异表达基因。
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TAB2的反义长链非编码RNA通过防止氧化应激促进哺乳动物卵泡生长
The antisense lncRNA of TAB2 that prevents oxidative stress to enhance the follicular growth in mammals.
实验完整度
高体外细胞实验（H2O2处理、过表达/敲低）、RNA-seq、体内卵泡培养和小鼠模型，包含功能验证和机制验证。
主要模型
猪卵巢颗粒细胞（GCs） 猪卵巢卵泡（体外培养） C57BL/6J小鼠（卵巢内注射慢病毒）
重点核对
H2O2浓度：100 μM用于后续实验 TAB2-AS过表达载体浓度：1000 ng/mL TAB2-AS敲低寡核苷酸浓度：100 nM 小鼠慢病毒注射剂量：1×10^7 TU，每周一次，共三周 体内卵泡培养的慢病毒滴度：1×10^6 TU
摘要
长链非编码RNA（LncRNAs）在哺乳动物卵泡生长过程中与氧化应激（OS）密切相关。TAK1结合蛋白2基因（TAB2）已被认为参与颗粒细胞（GCs）的正常凋亡和增殖，颗粒细胞是卵巢卵泡中的主要支持细胞。在本研究中，我们发现TAB2通过增加SOD1、P50和P65的表达来抑制氧化应激，从而抑制GCs的凋亡并促进其增殖。值得注意的是，DNMTs似乎介导了TAB2的表达，而TAB2启动子的DNA甲基化没有变化。我们鉴定了TAB2的反义lncRNA，发现DNA甲基化调控了GCs中TAB2-AS的转录，并发现TAB2-AS在体内介导了卵巢的卵泡生长。机制上，CpG位点（-1759/-1760）的低甲基化激活了TAB2-AS的转录，TAB2-AS的1-155 nt和156-241 nt分别与TAB2 mRNA的4368-4534 nt和4215-4300 nt互补，从而增加TAB2的表达。此外，TAB2-AS抑制了GCs的氧化应激和凋亡，同时促进GCs的增殖以加速卵泡生长，这与TAB2的作用一致。总之，这些发现揭示了由DNA甲基化介导的反义lncRNA机制，TAB2-AS可能是控制哺乳动物卵泡生长过程中氧化应激的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA甲基化调控的lncRNA如何影响哺乳动物卵泡生长？
- 核心机制
- TAB2-AS通过与其mRNA的互补区域结合，上调TAB2表达，进而激活NF-κB通路，抑制氧化应激和颗粒细胞凋亡，促进增殖，加速卵泡生长。
- 主要证据
- 体外GCs实验显示TAB2-AS过表达抑制ROS和凋亡、促进增殖，敲低则相反；体内小鼠模型显示TAB2-AS过表达促进黄体形成、E2分泌、性成熟和产仔数，敲低则抑制。
- 研究意义
- 揭示了DNA甲基化介导的反义lncRNA调控机制，TAB2-AS可能是控制哺乳动物卵泡生长过程中氧化应激的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TAB2对颗粒细胞凋亡和增殖的影响
验证TAB2是否影响颗粒细胞的凋亡和增殖
过表达或敲低TAB2，检测凋亡相关基因（Caspase-9、BIM）和增殖相关基因（PCNA、CCNE1）的表达，并通过流式细胞术和EdU实验检测凋亡和增殖水平。
TAB2-AS的鉴定及表达调控
鉴定TAB2的反义lncRNA，并探究其表达调控机制
基于RNA-seq鉴定TAB2-AS，通过5'/3' RACE获取全长；使用5-Aza-CdR和DNMTs敲低处理GCs检测TAB2-AS表达；在不同大小卵泡中检测TAB2-AS表达和启动子甲基化状态。
TAB2-AS与TAB2 mRNA的结合及对TAB2表达的影响
验证TAB2-AS是否通过与TAB2 mRNA结合上调其表达
通过ChIRP实验验证TAB2-AS与TAB2 mRNA的结合；克隆TAB2-AS的重叠区域并过表达，检测TAB2表达；使用EGFP融合载体验证TAB2-AS的非编码性；通过FISH和核质分离确定其亚细胞定位。
TAB2-AS对颗粒细胞功能的影响及依赖TAB2
验证TAB2-AS调控GCs功能是否依赖TAB2
过表达或敲低TAB2-AS，检测氧化应激、凋亡、增殖相关指标；并在TAB2-AS过表达的同时敲低TAB2，或反之，观察对GCs功能的影响。
TAB2-AS对卵泡生长和性成熟的体内验证
评估TAB2-AS在体内对卵泡生长和性成熟的影响
在猪卵泡培养和小鼠卵巢中通过慢病毒感染过表达或敲低TAB2-AS，检测相关基因表达、卵泡形态、凋亡、黄体数量、血清E2水平、性成熟时间及产仔数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 卵泡培养 | DMEM/F12培养基 | Pricella | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| 逆转录PCR | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| RT-qPCR | Maxima SYBR Green qRT-PCR预混液 | Thermo Scientific | -- |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| BCA蛋白定量试剂 | BioSharp | -- | |
| eBlot L1转膜仪 | GenScript | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗TAB2抗体 | Proteintech | 14410-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Affinity | AF7010 | |
| 抗PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| 抗CCNE1抗体 | Affinity | AF4713 | |
| 抗Caspase-9抗体 | Affinity | AF6348 | |
| 抗BIM抗体 | Signalway | 21280-1 | |
| 抗P50抗体 | Signalway | 21017 | |
| 抗P65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗SOD1抗体 | Proteintech | 10269-1-AP | |
| 羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | ab150079 | |
| Odyssey Fc成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 亚硫酸盐测序PCR | 组织DNA提取试剂盒 | Omega Bio-tek | D3396-02 |
| EZ DNA甲基化金试剂盒 | ZYMO RESEARCH | D5006 | |
| EdU实验 | Cell-Light EdU Apollo 567体外试剂盒 | RiboBio | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 流式细胞仪 | BD | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime Biotech | -- |
| Synergy Neo2多功能酶标仪 | BioTek | -- | |
| ChIRP实验 | Pierce磁性RNA蛋白下拉试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| ChIRP生物素探针 | RiboBio | -- | |
| RNA FISH | RNA FISH试剂盒和探针 | RiboBio | -- |
| RACE | SMARTer RACE 5'/3'试剂盒 | Takara | -- |
| 大肠杆菌Poly(A)聚合酶 | New England BioLabs | -- | |
| pMD18-T克隆载体 | Takara | -- | |
| ELISA | 小鼠E2 ELISA试剂盒 | JINGMEI Biotech | -- |
| 动物实验 | 慢病毒载体（rLV-TAB2-AS, sh-TAB2-AS） | Guangzhou Dongze | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞处理 | H2O2处理浓度和时间 阅读提示：见Results部分‘TAB2 activates NF-κB pathway to counteract OS of ovarian GCs’ |
| 基因操作 | TAB2过表达载体浓度（1500 ng/mL）和siRNA浓度（100 nM） 阅读提示：见Methods ‘Transient transfection’及Results |
| 基因操作 | TAB2-AS过表达载体浓度（1000 ng/mL）和敲低寡核苷酸浓度（100 nM） 阅读提示：见Results ‘An antisense lncRNA TAB2-AS was identified for TAB2’ |
| 表观遗传调控实验 | 5-Aza-CdR处理浓度和时间，DNMTs敲低效率 阅读提示：见Results ‘DNA methylation mediated TAB2-AS to promote the expression of TAB2’ |
| 体外卵泡培养 | 慢病毒感染滴度（1×10^6 TU）和培养时间（6天） 阅读提示：见Methods ‘Follicular culture’ |
| 动物实验 | 小鼠周龄（4周龄）、品系（C57BL/6J）、分组（每组5只）、注射剂量（1×10^7 TU）、频率（每周一次，共三周） 阅读提示：见Methods ‘Animals and lentivirus delivery’ |
| 功能检测 | ROS检测中DCFH-DA浓度（10 mM）和孵育时间（30 min） 阅读提示：见Methods ‘Detection of ROS’ |
| 功能检测 | 凋亡检测中Annexin V和PI的用量及孵育时间（15 min） 阅读提示：见Methods ‘Flow cytometry’ |