临床样本中DPY30表达分析
评估DPY30在结直肠癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的相关性。
通过qRT-PCR检测了25对CRC肿瘤及配对正常组织中DPY30的mRNA表达水平；通过IHC分析了包含94个CRC组织和86个配对癌旁组织的组织芯片中DPY30的蛋白表达；并通过Oncomine数据库分析验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
DPY30通过介导H3K4三甲基化促进结直肠癌细胞的增殖和细胞周期进程
DPY30 Promotes Proliferation and Cell Cycle Progression of Colorectal Cancer Cells via Mediating H3K4 Trimethylation.
实验完整度
高包含临床样本分析、细胞系功能验证（CCK-8、流式）、RNA-Seq转录组分析、ChIP机制验证及体内异种移植瘤模型，多个独立证据层级。
主要模型
结直肠癌细胞株（HT29、KM12C等） BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌小鼠模型 临床结直肠癌组织样本及组织芯片
重点核对
DPY30是否在人结直肠癌组织和细胞系中高表达，并与其临床病理特征相关 DPY30敲低后是否抑制CRC细胞增殖并诱导S期细胞周期阻滞 DPY30敲低是否下调PCNA、Ki67和cyclin A2的表达，并影响H3K4me3在其启动子区域的富集 DPY30敲低在体内异种移植模型中是否抑制肿瘤生长
摘要
DPY30是SET1/MLL组蛋白H3K4甲基转移酶复合物的核心亚基，通过基因转录的表观遗传调控在多种生物学功能中发挥重要作用，尤其是在癌症发展中。然而，其在人结直肠癌（CRC）中的作用尚未阐明。在这里，我们证明DPY30在CRC组织中过表达，并与病理分级、肿瘤大小、TNM分期和肿瘤位置显著相关。此外，DPY30敲低通过下调PCNA和Ki67在体外和体内显著抑制CRC细胞增殖，同时通过下调Cyclin A2诱导细胞周期阻滞于S期。在机制研究中，RNA-Seq分析显示，细胞增殖和细胞生长的富集基因本体显著受影响。ChIP结果表明，DPY30敲低抑制H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3），并减弱H3K4me3与PCNA、Ki67和cyclin A2的相互作用，导致其启动子区域H3K4me3建立的减少。综上所述，我们的结果表明DPY30的过表达通过介导H3K4me3促进PCNA、Ki67和cyclin A2的转录，从而促进CRC细胞增殖和细胞周期进程。这表明DPY30可能作为CRC的潜在治疗分子靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DPY30在结直肠癌中的表达及其对细胞增殖和细胞周期进程的作用机制尚不清楚，本研究旨在阐明。
- 核心机制
- DPY30通过介导H3K4me3的建立，促进PCNA、Ki67和cyclin A2的转录表达，从而促进CRC细胞增殖和细胞周期进程。
- 主要证据
- DPY30敲低在体外抑制CRC细胞增殖并诱导S期阻滞，在体内抑制肿瘤生长；ChIP实验显示DPY30敲低降低H3K4me3在PCNA、Ki67和cyclin A2启动子的富集；临床样本和组织芯片显示DPY30高表达与不良病理特征相关。
- 研究意义
- DPY30可能作为结直肠癌的潜在治疗分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞增殖和细胞周期分析
验证DPY30敲低对CRC细胞增殖能力及细胞周期分布的影响。
在HT29、SW480、caco2和KM12C细胞中通过shRNA稳定敲低DPY30，使用CCK-8检测细胞增殖，使用流式细胞术分析细胞周期，并检测周期相关蛋白的表达。
转录组分析识别DPY30调控的基因
通过RNA-Seq分析DPY30敲低后全基因表达变化，鉴定受影响的生物学过程。
对HT29-shCtrl和HT29-shDPY30细胞进行RNA-Seq测序，鉴定差异表达基因，并进行GO富集分析。
机制验证：DPY30调控H3K4me3修饰
验证DPY30敲低是否影响H3K4me3水平及其在靶基因启动子区域的富集。
通过Western blot检测H3K4me3总水平；通过ChIP-qPCR检测H3K4me3在PCNA、Ki67和cyclin A2启动子的富集。
体内动物实验验证肿瘤生长抑制
评估DPY30敲低对CRC体内致瘤性的影响。
将HT29-shDPY30和对照细胞皮下接种至BALB/c裸鼠，监测肿瘤体积和重量，并通过IHC和Western blot检测增殖相关蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | DPY30抗体（IHC） | Abcam | ab126352 |
| PCNA抗体 | Santa Cruz | sc-25280 | |
| Ki67抗体 | Santa Cruz | sc-23900 | |
| 细胞周期蛋白A抗体 | Santa Cruz | sc-271682 | |
| Western blot | α-辅肌动蛋白抗体 | Proteintech | 11313-2-AP |
| β-微管蛋白抗体 | Signalway Antibody | 48885 | |
| H3K4me3抗体 | CST | 9751 | |
| 组蛋白H3抗体 | CST | 4499 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶（含EDTA） | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | BasalMedia | -- | |
| shRNA质粒 | Public Protein/Plasmid Library (Geneppl) | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光试剂 | Biothrive | -- | |
| 免疫组织化学 | DAB显色试剂盒 | Maxim Biotechnologies | -- |
| RNA提取 | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP419 |
| 反转录 | FastQuant反转录试剂盒（含gDNase） | TIANGEN | KR106 |
| qRT-PCR | SuperReal PreMix Plus试剂盒 | TIANGEN | FP205 |
| ABI 7500快速荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | MedChemExpress | -- |
| RNA测序 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 细胞周期 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| ChIP | SimpleChIP Plus超声染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| Protein G磁珠 | Cell Signaling Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与稳定敲低 | 细胞系来源、培养条件（DMEM+10%FBS+双抗）、shRNA质粒序列及敲低效率 阅读提示：见Materials & Methods中的‘Cell culture and construction of stable knockdown cell lines’ |
| 细胞增殖实验 | 细胞接种密度（5×10^3细胞/孔）、检测时间点（24, 48, 72, 96小时）、CCK-8孵育时间（3小时） 阅读提示：见Materials & Methods中的‘Cell proliferation assay’ |
| 细胞周期分析 | 细胞饥饿时间（0, 12, 24小时）、恢复生长时间（24小时）、染色步骤 阅读提示：见Materials & Methods中的‘Cell cycle analyses’ |
| RNA-Seq | 细胞处理（HT29-shCtrl与shDPY30，三重复）、测序平台、差异表达基因筛选阈值（FDR≤0.05, FC≥2） 阅读提示：见Materials & Methods中的‘RNA isolation and sequencing and transcriptome analysis’ |
| ChIP实验 | 细胞交联条件、抗体（H3K4me3和IgG）、qPCR引物 阅读提示：见Materials & Methods中的‘Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay’和Table 1中ChIP引物 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系（BALB/c nude）、周龄（6-8周）、性别（雄性）、细胞接种量（5×10^6）、肿瘤体积测量频率（每2天）、实验周期（21天） 阅读提示：见Materials & Methods中的‘In vivo animal model’ |