鉴定PRMT5对Hippo通路的调控
确定PRMT5是否通过其甲基转移酶活性影响Hippo信号通路。
在胰腺癌细胞中敲除PRMT5或用GSK3326595抑制PRMT5，检测Hippo通路下游基因表达和蛋白磷酸化水平；回补PRMT5 WT或酶活性突变体（G367A/R368A）验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PRMT5对MST2的甲基化抑制Hippo信号通路并促进胰腺癌进展
MST2 methylation by PRMT5 inhibits Hippo signaling and promotes pancreatic cancer progression.
实验完整度
高包含体外细胞实验（PRMT5/MST2敲除、突变回补、激酶活性检测）、体内异种移植模型（裸鼠和PDX模型）及临床样本分析，并进行机制验证。
主要模型
胰腺癌细胞系PANC-1、CFPAC-1、BxPC-3、SW1990 HEK293T细胞 裸鼠异种移植瘤模型 患者来源异种移植瘤（PDX）模型 胰腺癌患者组织样本
重点核对
细胞系：PANC-1、CFPAC-1、BxPC-3、SW1990、HEK293T 基因敲除：CRISPR/Cas9介导的PRMT5、MST2、PRMT7、PRMT9敲除 药物处理：GSK3326595浓度（0.5μM、10μM、20μM等）和时间（24h、72h、6天等） 动物模型：BALB/c裸鼠和NOG小鼠，细胞注射量5×10^6，PDX模型建立方法 检测指标：Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、Co-IP、激酶活性测定
摘要
Hippo信号轴是一种肿瘤抑制通路，由多种通路外因子激活，以调节细胞分化和器官发育。最近的研究报道，核心激酶盒的自磷酸化刺激Hippo信号级联的激活。在这里，我们证明蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）有助于胰腺癌中Hippo信号通路失活。我们表明，Hippo通路起始丝氨酸/苏氨酸激酶3（STK3，也称为MST2）可以被PRMT5在其SARAH结构域的461位精氨酸（R461）和467位精氨酸（R467）上对称二甲基化。甲基化通过阻断其同源二聚化抑制MST2自磷酸化和激酶活性，从而使胰腺癌中的Hippo信号通路失活。此外，我们还表明，特异性PRMT5抑制剂GSK3326595重新激活失调的Hippo信号通路，并抑制免疫缺陷小鼠中人胰腺癌异种移植物的生长，从而提示PRMT5抑制剂在胰腺癌中的潜在临床应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PRMT5如何通过精氨酸甲基化调控Hippo信号通路，并影响胰腺癌的进展？
- 核心机制
- PRMT5在MST2的SARAH结构域R461和R467位点催化对称二甲基化，阻断MST2同源二聚化，抑制其自磷酸化和激酶活性，导致Hippo通路失活，YAP核转位增加，促进胰腺癌进展。
- 主要证据
- 通过SDMA-shotgun和点突变实验证明MST2在R461/R467被PRMT5对称二甲基化；Co-IP和GST pull-down显示PRMT5与MST2结合并阻断其同源二聚化；体内外实验表明MST2甲基化缺失或PRMT5抑制可恢复Hippo通路活性，抑制胰腺癌细胞增殖和肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示PRMT5介导的MST2甲基化是Hippo通路失活的新机制，为胰腺癌的靶向治疗（PRMT5抑制剂）提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MST2的甲基化修饰及位点
确认MST2是否被PRMT5对称二甲基化，并鉴定修饰位点。
通过SDMA-shotgun、免疫沉淀和Western blot检测内源或外源MST2的SDMA水平；构建MST2突变体（R461K、R467K、R461/467K）验证；体外甲基化实验确认PRMT5催化的特异性。
验证PRMT5与MST2的相互作用及对甲基化的影响
确定PRMT5是否直接结合MST2并催化其甲基化。
通过Co-IP检测内源或外源MST2与PRMT5结合；敲除PRMT5、PRMT7、PRMT9或过表达PRMT5观察SDMA变化；GST pull-down确定结合区域（SARAH结构域）。
探究MST2甲基化对Hippo通路激活的影响
明确MST2甲基化是否抑制其激酶活性及下游信号。
在MST2敲除细胞中回补MST2 WT或突变体，检测LATS1/YAP磷酸化、下游基因表达、细胞增殖和体内肿瘤生长；检测MST2自磷酸化（Thr180）和激酶活性。
验证PRMT5对MST2同源二聚化及自磷酸化的抑制
阐明PRMT5通过甲基化MST2阻断同源二聚化，从而抑制自磷酸化的机制。
通过Co-IP检测Flag-MST2与GFP-MST2的相互作用；戊二醛交联实验分析单体/二聚体状态；检测pMST2-Thr180水平和激酶活性。
临床样本和体内模型验证相关性及治疗潜力
在患者样本和PDX模型中验证PRMT5-MST2甲基化轴与胰腺癌进展的关系，并评估PRMT5抑制剂的治疗潜力。
利用组织芯片和配对组织进行IHC和Co-IP/WB分析；建立PDX模型，用GSK3326595处理，评估肿瘤生长和信号通路恢复情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 支原体清除剂 | InvivoGen | ant-mpp | |
| 胰蛋白酶溶液 | Gibco | 25200072 | |
| 药物处理 | 腺苷二醛 | Selleck | S8608 |
| MG132 | Med Chem Express | HY-13259 | |
| GSK3326595 (Pemrametostat, EPZ015938) | Selleck | S8664 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| PVDF膜 | Beyotime | FFP24 | |
| ECL发光液 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Bio-Rad Image Lab | Bio-Rad | -- | |
| Co-immunoprecipitation | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Thermo Fisher Scientific | 20421 |
| 抗Flag磁珠 | Beyotime | P2115 | |
| 抗HA磁珠 | Beyotime | P2121 | |
| 抗Myc磁珠 | Beyotime | P2118 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| 5× HiScript III qRT SuperMix | Vazyme | R323-01 | |
| 2× AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q111-02 | |
| 免疫荧光 | 山羊血清 | Beyotime | C0265 |
| FITC-鬼笔环肽 | Solarbio | CA1610 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| 共聚焦显微镜 (Andor Dragonfly) | Andor | -- | |
| 亚细胞分级 | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 |
| MTS assay | MTS试剂 | Solarbio | G1110 |
| 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 | |
| 酶标仪 | 文中未明确说明 | -- | |
| 克隆形成 | 结晶紫染色液 | Beyotime | C0121 |
| 激酶活性检测 | Kinase-Lumi™ Max发光激酶检测试剂盒 | Beyotime | S0158S |
| 3× Flag肽 | Beyotime | P9801 | |
| GST pull-down | 抗GST磁珠 | Beyotime | P2138 |
| 大肠杆菌BL21 | Beyotime | D0337 | |
| 体外激酶实验 | His标签蛋白纯化试剂盒 | Beyotime | P2226 |
| ATP | Solarbio | A0159 | |
| 体外甲基化实验 | S-腺苷-L-甲硫氨酸 | Solarbio | A0205 |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 抗体 | anti-α-me2s抗体 (CST) | Cell Signaling Technology | 13222 |
| anti-α-me2s抗体 (Antibodies-online) | Antibodies-online | ABIN870728 | |
| anti-MST2抗体 (Proteintech) | Proteintech | 12097-1-AP | |
| anti-MST2抗体 (ABclonal) | ABclonal | A9036 | |
| anti-MST2抗体 (CST) | Cell Signaling Technology | 3952 | |
| anti-Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| anti-GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| anti-pLATS1-Ser909抗体 | Signalway Antibody | C13033 | |
| anti-pLATS1-Thr1079抗体 | Signalway Antibody | C13032 | |
| anti-LATS1抗体 | Proteintech | 17049-1-AP | |
| anti-pYAP1-Ser127抗体 | Signalway Antibody | 11952 | |
| anti-pYAP1-Ser397抗体 | Signalway Antibody | 13443 | |
| anti-YAP1抗体 | Proteintech | 13584-1-AP | |
| anti-CYR61抗体 | Proteintech | 26689-1-AP | |
| anti-CTGF抗体 | Proteintech | 25474-1-AP | |
| anti-HDAC1抗体 | Proteintech | 10197-1-AP | |
| anti-HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| anti-GFP抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| anti-pMST2-Thr180抗体 | Affinity Biosciences | AF2367 | |
| anti-His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| anti-PRMT5抗体 | Proteintech | 18436-1-AP | |
| anti-PRMT7抗体 | Proteintech | 67669-1-Ig | |
| anti-PRMT9抗体 | ABclonal | A10491 | |
| anti-MEP50抗体 | Proteintech | 10115-1-AP | |
| anti-Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| anti-GST抗体 | Proteintech | 10000-0-AP | |
| anti-MST1抗体 | ABclonal | A8043 | |
| anti-SAV1抗体 | ABclonal | A9980 | |
| anti-AURKB抗体 | Abcam | ab287960 | |
| anti-ANKRD1抗体 | Proteintech | 11427-1-AP | |
| 二抗 | AffiniPure山羊抗兔IgG (H+L) | AMSBIO | BA1039 |
| AffiniPure山羊抗鼠IgG (H+L) | AMSBIO | BA1038 | |
| CY3偶联AffiniPure山羊抗兔IgG (H+L) | AMSBIO | BA1032 | |
| 小鼠抗兔IgG（构象特异性）(L27A9)单克隆抗体（HRP偶联） | Cell Signaling Technology | 5127 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分（DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素、5μg/ml支原体清除剂）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines and cell culture |
| 基因敲除和回补 | sgRNA序列（见表1）、lentiCRISPR v2载体、敲除细胞系（PANC-1, CFPAC-1）、回补质粒（PRMT5 WT/G367A/R368A, MST2 WT/RK突变体）、转染试剂（Lipofectamine 2000）、筛选抗生素（嘌呤霉素浓度） 阅读提示：Materials and Methods: CRISPR/Cas9 technique, Plasmid transfection, Lentiviral infection |
| 药物处理 | GSK3326595浓度（0.1μM, 0.5μM, 10μM, 20μM等）和处理时间（24h, 48h, 72h, 6天等）；AdOx浓度和时间 阅读提示：Results和Figure legends（如图1、3、5） |
| 蛋白检测 | 抗体信息（表1）、稀释比（如α-me2s 1:1000）、裂解液成分、样品制备、SDS-PAGE和转膜条件 阅读提示：Materials and Methods: Western blot analysis, Antibodies and chemicals |
| Co-IP | 裂解液（Beyotime）、磁珠类型（Anti-Flag/HA/Myc/GST）、孵育时间（4°C 12h）、洗涤次数 阅读提示：Materials and Methods: Co-immunoprecipitation |
| 体外实验 | 重组蛋白表达和纯化（His-tag试剂盒，GST磁珠）、SAM浓度（100μM）、ATP浓度（0.5mM） 阅读提示：Materials and Methods: In vitro kinase assay, In vitro methylation assay |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠、NOG小鼠）、年龄（4周）、注射细胞数（5×10^6）、给药剂量（100mg/kg）、给药频率（每3天）、肿瘤测量时间点 阅读提示：Materials and Methods: Nude mice xenograft tumor model, Patient-derived tumor xenograft model |
| 临床样本分析 | 样本来源、配对数量（12对）、组织芯片（37例）、抗体（PRMT5, α-me2s, pMST2-Thr180）、IHC评分标准 阅读提示：Materials and Methods: Clinical specimen collection, Immunohistochemistry |