smRNA合成与转染效率验证
验证smRNA能否高效转染NPC并表达目标蛋白
通过T7启动子IVT合成eGFP、OLIG2WT和OLIG2S147A的smRNA，利用阳离子脂质体转染NPC，检测转染效率和蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用OLIG2合成修饰信使RNA快速分化为功能性少突胶质细胞
Rapid differentiation of hiPSCs into functional oligodendrocytes using an OLIG2 synthetic modified messenger RNA.
实验完整度
高包含体外细胞分化验证、流式检测、免疫荧光、蛋白质组学、药物干预、siRNA敲低及体内移植模型等多个证据层级。
主要模型
hiPSC来源的神经前体细胞（NPC） 杯噬素诱导脱髓鞘小鼠模型
重点核对
smRNA转染效率：eGFP smRNA 300ng转染NPC效率大于95% OLIG2S147A与OLIG2WT的蛋白表达差异：S147A较WT在16h高1.2倍，24h达峰值 OLIG2S147A smRNA六次每日转染促进SOX10表达，较三次高9.8倍 OLIG2S147A smRNA诱导NG2+ OPC比例达74.94%±2.68%，WT仅27.72%±1.25% 体内移植：将纯化O4+ OPC注入杯噬素小鼠脑内，8周后检测到人源细胞表达MBP，并形成致密髓鞘
摘要
转录因子已被用于驱动人诱导多能干细胞高效分化为谱系特异性少突胶质细胞。然而，目前有效的策略主要依赖于基因组整合病毒。这里我们展示了一种基于合成修饰信使RNA的重编程方法，可产生无转基因的少突胶质细胞。设计了一种编码OLIG2修饰形式（丝氨酸147磷酸化位点替换为丙氨酸，OLIG2S147A）的合成修饰信使RNA，用于将人诱导多能干细胞重编程为少突胶质细胞。我们证明，重复给予编码OLIG2S147A的合成修饰信使RNA可实现更高、更稳定的蛋白表达。利用单突变体OLIG2合成修饰信使RNA形态发生素，我们建立了一个6天的合成修饰信使RNA转染方案，胶质诱导导致从人诱导多能干细胞快速产生NG2+少突胶质前体细胞（纯度>70%）。合成修饰信使RNA诱导的NG2+少突胶质前体细胞可在体外成熟为功能性少突胶质细胞，并在体内促进髓鞘再生。总之，我们提出了一种安全高效、由合成修饰信使RNA驱动的人诱导多能干细胞向少突胶质细胞分化策略，可能用于神经退行性疾病患者的治疗性少突胶质前体细胞/少突胶质细胞移植。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何安全、高效地利用合成修饰mRNA将hiPSC分化为功能性少突胶质细胞？
- 核心机制
- OLIG2S147A通过阻断S147磷酸化，增强蛋白稳定性并促进OLIG2的转录活性，与HSP70复合物（HSPA5、HSPA8、HSPA9）结合后进一步驱动少突胶质系分化。
- 主要证据
- 体外实验显示OLIG2S147A smRNA较野生型更有效诱导NG2+/PDGFRα+ OPC生成，且O4+细胞比例随时间增加；体内移植实验显示，移植的OPC在杯噬素小鼠脑内分化为MBP+ OL并促进髓鞘再生。
- 研究意义
- 提供了一种无病毒整合的smRNA驱动hiPSC分化为OL的方法，可用于脱髓鞘疾病模型和细胞治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定最佳转染方案
比较不同转染次数和OLIG2类型对下游基因SOX10表达的影响
对hiPSC来源NPC进行3次或6次每日转染OLIG2WT或OLIG2S147A smRNA，检测SOX10 mRNA表达。
诱导OPC生成
评估OLIG2 smRNA能否促进NPC分化为OPC
NPC在六天每日转染后，在GIM和DM中培养，通过免疫荧光和流式检测NG2、PDGFRα等OPC标志物。
OPC成熟为功能性OL
检验OPC能否在体外分化为成熟OL并表达髓鞘相关基因
在分化第7、14、21天流式检测O4+细胞比例，免疫荧光检测MBP表达，qPCR检测髓鞘基因mRNA水平。
体内移植验证髓鞘再生
评估smRNA诱导的OPC在脱髓鞘小鼠模型中能否促进髓鞘再生
将FACS纯化的O4+ OPC注射到杯噬素诱导脱髓鞘小鼠胼胝体，8周后通过免疫组化、TEM和LFB染色评估髓鞘形成。
蛋白质组学分析OLIG2结合蛋白
鉴定OLIG2S147A和WT的差异结合蛋白，探索分子机制
通过Flag IP结合LC-MS/MS分析鉴定差异结合蛋白，并验证HSP70复合物与OLIG2的相互作用。
验证HSP70复合物功能
检验HSP70活性对OLIG2S147A驱动的OL分化的影响
使用HSP70激动剂ML346和拮抗剂VER155008处理，以及siRNA敲低HSP70，检测MBP+ OL生成和SOX10表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| smRNA合成 | 抗反向帽类似物 | APExBIO | B8175 |
| 细胞培养 | mTeSR培养基 | Stem Cell Technologies | 85850 |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | -- | |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| SB431542 | -- | -- | |
| Compound E | -- | -- | |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | |
| 转染 | ScreenFect转染试剂 | Wako | 293-75901 |
| Lipofectamine 2000 | Data invention Biotech | DIB034 | |
| 细胞毒性检测 | CCK-8试剂盒 | Data Inventory Biotechnology | CK101-01 |
| 免疫荧光 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Vector Laboratories | -- |
| 免疫组化 | Luxol固蓝 | Servicebio | G1030 |
| 免疫印迹 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | EZ-Press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | B0004D |
| EZscript反转录试剂盒 | EZBioscience | RT3P | |
| SYBR Green I实时PCR试剂 | Foregene | QP-01014 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | GenScript | L00277 |
| 抗Flag抗体 | Abcepta | AP1013A | |
| 流式 | NG2-PE抗体 | Signalway antibody | C06035P |
| PDGFRa-APC抗体 | BioLegend | 323512 | |
| BD FACSAria流式分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| Beckman Coulter CytoFLEXS流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 动物实验 | 杯噬素 | Dyets | D200218 |
| 环孢素 | -- | -- | |
| 汉密尔顿注射器 | NJKEWBIO | KW-ZSB | |
| 蛋白组学 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| smRNA合成与转染 | smRNA序列、修饰核苷酸（5-methylcytidine、pseudouridine）及ARCA的使用 阅读提示：Methods: smRNA synthesis and cell transfection |
| hiPSC培养与神经分化 | hiPSC系、培养条件（mTeSR、Matrigel）、NIM1/2成分及培养时间 阅读提示：Methods: hiPSC culture and neural differentiation |
| OPC分化 | NPC种植密度、转染次数、GIM/DM成分及处理时间 阅读提示：Methods: OPC differentiation |
| OPC成熟检测 | 流式检测时间点（第7、14、21天）、O4+细胞比例、MBP免疫荧光 阅读提示：Figure 3 legend, Methods: Flow cytometry analysis |
| 体内移植 | 动物品系、年龄、性别、cuprizone饮食浓度及时间、移植细胞数、注射坐标、免疫抑制方案 阅读提示：Methods: Transplantation of smRNA-induced OPCs in a cuprizone-induced demyelination mouse model |