验证BRAP表达与分布
确认BRAP在人类和小鼠肺组织中的表达位置和细胞类型，以推测其潜在功能。
使用免疫组化检测人肺组织（肺纤维化、肺炎、肺结核）中BRAP表达；使用免疫荧光和Western blotting检测HLF细胞和人/小鼠肺组织中BRAP表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
缺乏蛙皮素受体激活蛋白可减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化
Lack of bombesin receptor-activated protein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.
实验完整度
高包含动物模型、细胞实验、分子机制验证等多个证据层级，有功能验证（增殖、胶原）和机制验证（酵母双杂交、CoIP、自噬流）
主要模型
BC004004−/−小鼠（C57BL/6背景） 博来霉素诱导的肺纤维化模型 原代小鼠肺成纤维细胞 16HBE14o-人支气管上皮细胞系
重点核对
小鼠基因型（BC004004+/+ vs BC004004−/−） 博来霉素剂量：3.5 mg/kg，气管内滴注 TGF-β1刺激浓度：10 ng/ml 自噬流检测：Ad-mCherry-GFP-LC3B或Ad-GFP-p62转导，25 μM氯喹处理24小时 Western blot抗体：BRAP (ab181073)、ATG5 (133158)、LC3 (12741)
摘要
蛙皮素受体激活蛋白（BRAP）被发现表达于人纤维化肺间质细胞中，其功能未知。其同源蛋白由BC004004基因编码，也存在于小鼠肺组织中。我们使用缺乏BRAP同源蛋白表达的BC004004−/−小鼠建立博来霉素诱导的肺纤维化模型。博来霉素处理后，BC004004−/−小鼠表现出肺损伤减轻和肺纤维化程度降低。来自BC004004−/−小鼠的成纤维细胞增殖速率较低，胶原产生较少。自噬相关基因5（ATG5）被鉴定为与人BRAP相互作用的伙伴。缺乏BRAP同源蛋白导致小鼠肺组织及分离的肺成纤维细胞自噬活性增强，表明该蛋白通过与ATG5相互作用对自噬起负调控作用。成纤维细胞中因缺乏BRAP同源蛋白而增强的自噬过程可能有助于BC004004−/−小鼠对肺纤维化的抵抗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BRAP在博来霉素诱导的肺纤维化中扮演何种角色？其潜在机制是什么？
- 核心机制
- BRAP同源蛋白通过与ATG5相互作用负调控自噬，缺乏该蛋白可增强成纤维细胞自噬，抑制胶原产生，从而减轻肺纤维化。
- 主要证据
- BC004004−/−小鼠在博来霉素处理后肺损伤和纤维化减轻，其肺成纤维细胞增殖减慢、胶原产生减少、自噬活性增强；酵母双杂交、CoIP和pull-down证实BRAP与ATG5直接相互作用；TGF-β1诱导的Smad3磷酸化减弱，且SIS3或雷帕霉素处理可抑制TGF-β1诱导的胶原表达。
- 研究意义
- 此项研究揭示BRAP通过自噬途径调控胶原产生的新机制，为肺纤维化的治疗提供了潜在的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立博来霉素诱导肺纤维化模型并评估损伤和纤维化
评估BC004004−/−小鼠对博来霉素诱导的肺损伤和纤维化的抵抗性。
对BC004004+/+和BC004004−/−小鼠气管内滴注博来霉素或生理盐水，观察体重、肺组织病理、Ashcroft评分、BALF细胞数、胶原沉积（Masson、Sirius Red）、COL1A1、α-SMA、TGF-β1、羟脯氨酸含量。
体外分离肺成纤维细胞并检测增殖、凋亡、胶原产生和TGF-β信号
研究BRAP同源蛋白对肺成纤维细胞功能的影响，包括增殖、凋亡、胶原产生和对TGF-β1刺激的反应。
分离原代肺成纤维细胞，用TGF-β1刺激，检测增殖（CCK8）、细胞周期、凋亡（Annexin V/PI）、羟脯氨酸含量、α-SMA和COL1A2表达、Smad3磷酸化、mRNA表达。
酵母双杂交筛选和验证BRAP相互作用蛋白
鉴定与BRAP相互作用的蛋白，以揭示其功能机制。
使用酵母双杂交筛选人cDNA文库，鉴定到ATG5；构建全长ATG5质粒，验证与BRAP-CTD的相互作用；通过CoIP和pull-down进一步验证。
检测自噬活性
验证BRAP同源蛋白缺乏对自噬的影响。
在肺组织和分离的肺成纤维细胞中检测LC3和p62水平，使用LC3B和p62荧光融合蛋白监测自噬流，并通过透射电镜观察自噬体。
验证自噬对胶原产生的影响
确定增强的自噬是否导致胶原减少。
通过饥饿或雷帕霉素处理增强自噬，检测COL1A2和COL3A1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | 抗BRAP兔单克隆抗体（EPR13621） | Abcam | ab181073 |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | ZSGB-Bio | PV-6002 | |
| DAB显色试剂 | Boster | AR1027-1 | |
| 苏木素 | Servicebio | G1004 | |
| GVA封片剂 | ZSGB-Bio | ZLI-9551 | |
| 免疫荧光 | Alexor Fluor 488标记驴抗兔荧光二抗 | Jackson ImmunoResearch | AB_2313584 |
| DAPI染色液 | Servicebio | G1012 | |
| Alexor Fluor 594标记山羊抗小鼠荧光二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 羟脯氨酸检测 | 羟脯氨酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A030-2-1 |
| qRT-PCR | RNAiso Plus总RNA提取试剂 | Takara | 9108 |
| Prime Script RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047B | |
| SYBR Premix Ex Taq II试剂 | Takara | RR420A | |
| 实时荧光定量PCR仪（CFX96 Touch） | Bio-Rad | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| SDS上样缓冲液 | DingGuo | 0091 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0006 | |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | SouthernBiotech | 4050-05 | |
| 抗β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8685 | |
| 磷酸化Smad3抗体 | Abcam | 52903 | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| ATG5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | 133158 | |
| TGF-β1抗体 | Abcam | ab64715 | |
| LC3抗体 | Cell Signaling Technology | 12741 | |
| p62抗体 | Cell Signaling Technology | 5114 | |
| COL1A1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-293182 | |
| COL1A2抗体 | Sangon | D120244 | |
| COL3A1抗体 | Abcam | ab184993 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1 | |
| HIS3抗体 | Servicebio | GB11102 | |
| NF-κB p65抗体 | Signalway Antibody | 48676 | |
| RelB抗体 | Abcam | ab154957 | |
| NF-κB p65抗体 | Abcam | ab31481 | |
| NF-κB p65 (磷酸化S536)抗体 | Abcam | ab86299 | |
| LaminB1抗体 | Abcam | ab133741 | |
| S100A4抗体 | Servicebio | GB11397 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胶原酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| 70 μm BD falcon细胞筛网 | BD | -- | |
| 细胞处理 | 重组小鼠TGF-β1 | R&D Systems | 7666-MB-005/CF |
| SIS3（Smad3磷酸化抑制剂） | 文中未明确说明 | -- | |
| 雷帕霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 氯喹 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK8细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | C0038 |
| 自噬流检测 | 表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒 | Beyotime | C3011 |
| 表达GFP-p62融合蛋白的腺病毒 | Beyotime | C3015 | |
| 酵母双杂交 | Matchmaker Gold酵母双杂交系统 | Clontech | 630489 |
| 通用人cDNA文库 | Clontech | 630480 | |
| X-α-Gal底物 | 文中未明确说明 | -- | |
| 酵母质粒小提试剂盒 | Beyotime | D0029 | |
| 免疫共沉淀 | 磁珠偶联蛋白A | Invitrogen | 10001D |
| 核蛋白提取 | NE-PER核蛋白和胞浆蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 |
| 流式分析 | 碘化丙啶溶液 | Beyotime | C1052 |
| FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Pharmingen | 556547 | |
| Pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖树脂 | Pierce | 16100 |
| pMAL载体 | New England Biolabs | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | 文中未明确说明 | -- | |
| 组织蛋白酶B活性检测 | Magic Red组织蛋白酶检测试剂盒 | Bio-Rad | ICT937 |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6背景）、基因型（BC004004+/+ vs BC004004−/−）、年龄（6周龄）、体重（17-20g）、博来霉素剂量（3.5 mg/kg）、给药方式（气管内滴注）、终点时间（Day 21） 阅读提示：Materials and Methods: Animals, Mouse model of bleomycin-induced lung injury |
| 组织病理学检测 | 组织固定（4%多聚甲醛）、切片厚度（3 μm）、染色方法（H&E、Masson、天狼星红）、纤维化评分（Ashcroft）、免疫组化条件（抗原修复、一抗浓度、孵育时间） 阅读提示：Materials and Methods: Histopathology and immunohistochemistry analysis |
| 细胞实验 | 成纤维细胞分离方法（1周龄小鼠）、培养条件（DMEM/F12、15% FBS、5% CO2）、TGF-β1浓度（10 ng/ml）、处理时间（48/72小时）、SIS3浓度（10 μM）、雷帕霉素浓度（1 μM） 阅读提示：Materials and Methods: Isolation and culture of fibroblasts from mouse lung tissue, CCK8 assay |
| 自噬检测 | 自噬流检测方法（mCherry-GFP-LC3B和GFP-p62腺病毒，MOI 1.25）、氯喹浓度（25 μM）、处理时间（24小时）、Western blot抗体（LC3、p62） 阅读提示：Materials and Methods: Autophagic flux assay; Figure 5 legend |
| 分子互作验证 | 酵母双杂交系统（Matchmaker Gold、pGBKT7-BRAP-CTD）、CoIP条件（1 μg抗体、25 μl磁珠）、pull-down条件（GST-ATG5、MBP-BRAP-CTD） 阅读提示：Materials and Methods: Yeast two-hybrid assay, Co-immunoprecipitation assay, Recombinant proteins expression and the pull down assay |