建立脑出血小鼠模型
模拟脑出血病理状态，用于评估鼻内胰岛素的效果。
采用自体血纹状体注射建立脑出血模型，将25 μL尾静脉血以2 μL/min速率注入纹状体（深度3.5 mm），术后24或72小时观察。
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鼻内胰岛素改善小鼠脑出血后的神经功能损伤
Intranasal insulin ameliorates neurological impairment after intracerebral hemorrhage in mice.
实验完整度
高包含自体血诱导脑出血模型、生存分析、神经功能评分、脑含水量、BBB通透性、血肿体积、FJB染色、Western blot等多层次功能与机制验证。
主要模型
自体血诱导脑出血小鼠模型(C57BL/6J雄性小鼠)
重点核对
胰岛素剂量（0.5、1、2 IU）及给药频率（每天两次） 给药时间点（术后24和72小时） 神经功能评分（NDS）和生存率分析 脑水肿、血脑屏障通透性和血肿体积的测量 AKT/GSK3β通路蛋白（p-AKT、p-GSK3β）的表达水平
摘要
在阿尔茨海默病和缺血性卒中中，鼻内胰岛素可作为神经保护剂。然而，鼻内胰岛素在脑出血中是否具有神经保护作用及其潜在机制仍知之甚少。本研究采用自体血诱导的脑出血小鼠模型，通过鼻内给药给予0.5、1或2 IU胰岛素，每天两次，直至术后24或72小时。与盐水治疗相比，1 IU鼻内胰岛素治疗显著减少了脑出血后的血肿体积和脑水肿，降低了血脑屏障通透性和神经元变性损伤，减少了神经行为缺陷，并提高了小鼠的存活率。鼻内胰岛素治疗后，血肿周围组织中p-AKT和p-GSK3β的表达水平显著升高。我们的研究结果表明，鼻内胰岛素治疗可通过AKT/GSK3β信号通路保护脑出血后小鼠的神经功能。该研究于2019年1月7日获得川北医学院伦理委员会批准（批准号：NSMC(A)2019(01)）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鼻内胰岛素是否能够改善脑出血后的神经功能损伤，其潜在机制是否与AKT/GSK3β信号通路有关？
- 核心机制
- 鼻内胰岛素通过激活AKT（增加p-AKT水平）并促进GSK3β磷酸化（增加p-GSK3β水平），从而抑制GSK3β活性，发挥神经保护作用。
- 主要证据
- 在自体血诱导的脑出血小鼠模型中，1 IU鼻内胰岛素显著降低血肿体积、脑水肿、BBB通透性和神经元变性，改善神经功能并提高生存率，同时Western blot显示p-AKT和p-GSK3β表达增加。
- 研究意义
- 研究支持鼻内胰岛素作为脑出血治疗策略的进一步研究，并指出AKT/GSK3β通路可作为脑出血的潜在药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鼻内胰岛素治疗
评估不同剂量鼻内胰岛素对脑出血后损伤的影响。
术后第一天起，每天两次鼻内给予生理盐水或0.5、1、2 IU胰岛素，直至术后24或72小时。
评估生存率和神经功能
确定鼻内胰岛素对脑出血后死亡率和神经行为缺陷的影响。
采用Kaplan-Meier生存分析评估生存率，使用28分神经功能缺陷评分（NDS）在术后24和72小时进行神经功能评估。
测量脑水肿、BBB通透性和血肿体积
评估鼻内胰岛素对脑组织损伤的改善作用。
通过干湿重法测量脑含水量，伊文思蓝染色评估BBB通透性，切片图像分析测量血肿体积。
评估神经元变性
观察鼻内胰岛素对脑出血后神经元变性的影响。
采用Fluoro-Jade B（FJB）染色，在荧光显微镜下计数血肿周围FJB阳性细胞。
检测AKT/GSK3β通路蛋白表达
探究鼻内胰岛素神经保护作用的分子机制。
通过Western blot检测血肿周围组织中AKT、p-AKT（Ser473）、GSK3β、p-GSK3β（Ser9）的表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物麻醉 | 异氟烷 | RWD Life Science | -- |
| 手术 | 立体定位仪 | Stoelting | -- |
| 汉密尔顿微量注射器 | Hamilton | -- | |
| 药物处理 | 胰岛素 | Novo Nordisk | -- |
| 脑含水量 | 分析天平 | Mettler Toledo | -- |
| BBB渗透性 | 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | -- |
| 分光光度计 | Beckman Coulter | -- | |
| 血肿测量 | OCT包埋剂 | SAKURA | -- |
| 冰冻切片机 | Leica Microsystems | CM1900 | |
| 神经元变性 | Fluoro-Jade B | Chemicon International | -- |
| 荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013E |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0010 | |
| PVDF膜 | Pall Crop. | -- | |
| 抗AKT抗体 | Signalway Antibody | 40567 | |
| 抗磷酸化AKT (ser473)抗体 | Signalway Antibody | 11054 | |
| 抗GSK3β抗体 | Signalway Antibody | 21002 | |
| 抗磷酸化GSK3β (ser9)抗体 | Signalway Antibody | 11002 | |
| 抗GAPDH抗体 | Beyotime Biotechnology | AF5009 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Signalway Antibody | L3012-2 | |
| 山羊抗鼠IgG二抗 | Signalway Antibody | L3032-2 | |
| Western印迹剥离缓冲液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 雄性C57BL/6J小鼠，6-8周龄，体重22-25 g；自体血25 μL注入纹状体，深度3.5 mm；模型成功率88%，排除NDS<4或术中死亡 阅读提示：Methods: Animals, ICH model |
| 药物干预 | 胰岛素剂量0.5, 1, 2 IU，每天两次鼻内给药，直至术后24或72小时 阅读提示：Methods: Intranasal insulin treatment |
| 生存率和神经功能 | 每组n=30；NDS评分（28分制）在24和72小时进行；Kaplan-Meier分析 阅读提示：Methods: Survival analysis, Neurological impairment assessment, Results: Figure 1 |
| 脑水肿和BBB通透性 | 每组n=6；脑含水量测量用干湿重法；BBB通透性用2%伊文思蓝4 mL/kg静脉注射，循环3小时；定量检测 阅读提示：Methods: Brain water content measurement, Evaluation of BBB permeability, Results: Figure 2 |
| 血肿体积 | 每组n=3；100 μm冠切，ImageJ测量，体积计算 阅读提示：Methods: Hematoma measurement, Results: Figure 2 |
| 神经元变性 | 每组n=3；FJB染色，荧光显微镜计数阳性细胞 阅读提示：Methods: Evaluation of neuronal degeneration, Results: Figure 3 |
| 通路检测 | 每组n=6；Western blot检测p-AKT、p-GSK3β表达；抗体稀释度：抗AKT 1:500，抗p-AKT 1:500，抗GSK3β 1:600，抗p-GSK3β 1:600 阅读提示：Methods: Western blot assay, Results: Figure 4 |