原苏木素A和齐墩果酸通过抑制AKT-mTOR信号通路保护受损足细胞免受凋亡

Protosappanin-A and oleanolic acid protect injured podocytes from apoptosis through inhibition of AKT-mTOR signaling.

作者信息Jiaxin Zheng, Shoulin Zhang, Huijun Chen, Xiaojun Cai, Chunjian Zhang, Shuhua Li, Yabin Zhou, Jing Shang, Shunyu Liang, Fengzhen Yao
PMID31441181
发布时间2020-01
DOI10.1002/cbin.11218

实验完整度

包含体外细胞模型、凋亡检测、基因和蛋白表达分析及信号通路验证,但缺乏体内模型和临床样本验证。

主要模型

MPC5小鼠足细胞系 sC5b-9诱导的足细胞损伤体外模型

重点核对

sC5b-9浓度:0.8 μg/mL PrA和OA处理浓度:80 μM IGF-1浓度:100 ng/mL LY294002浓度:5 μM C5b-6复合物与正常人血清(NHS)比例:1:80

摘要

原苏木素A(PrA)和齐墩果酸(OA)是从苏木(Caesalpinia sappan L.)中分离的重要有效成分,在多种疾病中表现出治疗潜力。本研究旨在探讨PrA和OA在足细胞损伤中的作用机制。通过sC5b-9复合物诱导足细胞损伤的体外模型,并采用细胞活力、凋亡、免疫荧光、实时定量聚合酶链反应和western blot等检测方法,进一步研究PrA和OA在足细胞损伤中的作用和机制。足细胞损伤模型被验证成功,表现为nephrin、podocin和CD2AP水平显著降低,desmin水平升高。在受损足细胞中,PrA和OA处理抑制了sC5b-9诱导的足细胞凋亡,同时伴有nephrin、podocin、CD2AP和Bcl2蛋白水平升高,desmin和Bax水平降低。PrA和OA处理还降低了p-AKT/p-mTOR水平,而AKT/mTOR未改变。此外,PrA和OA对受损足细胞的作用与LY294002(一种PI3K-AKT抑制剂)相似。PrA和OA也被观察到抑制IGF-1(一种PI3K-AKT激活剂)诱导的足细胞凋亡和p-AKT/p-mTOR水平。我们的数据表明,PrA和OA可以保护足细胞免受损伤或凋亡,这可能是通过抑制AKT-mTOR信号的异常激活实现的。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PrA和OA是否以及如何保护足细胞免受sC5b-9诱导的损伤和凋亡?
核心机制
PrA和OA通过抑制AKT-mTOR信号通路的异常激活来保护足细胞免受凋亡。
主要证据
体外实验显示,PrA和OA处理降低了sC5b-9诱导的足细胞凋亡,恢复了nephrin、podocin、CD2AP和Bcl2的表达,降低了desmin和Bax,并抑制了p-AKT/p-mTOR水平;其作用与LY294002相似,并能逆转IGF-1的效应。
研究意义
该研究揭示了一种治疗肾小球疾病中足细胞损伤的潜在新疗法。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立足细胞损伤模型

验证sC5b-9复合物能否诱导足细胞损伤并确定最佳浓度。

使用不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL)的C5b-6复合物和正常人血清(NHS)处理分化的MPC5足细胞,通过CCK-8、LDH检测和免疫荧光评估细胞活力和sC5b-9沉积。

2

评估sC5b-9对足细胞凋亡和标志物表达的影响

确定sC5b-9诱导足细胞损伤的表型变化。

用0.1和0.8 μg/mL的C5b-6处理细胞,通过流式细胞术检测凋亡,western blot和免疫荧光检测nephrin、podocin、CD2AP和desmin的表达。

3

检测PrA和OA对受损足细胞活力的影响

确定PrA和OA的最佳保护浓度。

用不同浓度(0, 10, 20, 40, 80, 160 μM)的PrA和OA处理受损足细胞,通过CCK-8检测细胞活力。

4

验证PrA和OA对足细胞凋亡和相关基因表达的影响

验证PrA和OA对足细胞凋亡和分子标志物的保护作用。

受损足细胞分别用80 μM PrA、80 μM OA、两者联合或5 μM LY294002处理,通过流式细胞术、qRT-PCR和western blot检测凋亡及相关基因和蛋白表达。

5

验证PrA和OA通过抑制AKT-mTOR信号通路发挥作用

确认PrA和OA对AKT-mTOR信号通路的抑制作用及其功能相关性。

用100 ng/mL IGF-1(PI3K-AKT激活剂)单独或与PrA和OA联合处理足细胞,通过流式细胞术检测凋亡,western blot检测AKT/mTOR磷酸化水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI-1640培养基HycloneSH30809.01B
胎牛血清Gibco16000-044
青霉素-链霉素Invitrogen--
干扰素γPeprotech315-05
C5b-6复合物Merck204906-50UGCN
原苏木素ABiopurify102036-28-2
齐墩果酸Sigma42515
LY294002SelleckS1105
胰岛素样生长因子1Peprotech100-11
CCK-8检测试剂盒Signalway Antibody LLC (SAB)CP002
TRIzol试剂Invitrogen1596-026
逆转录酶Fermentas#K1622
SYBR Green PCR试剂盒Thermo Fisher Scientific#K0223
RIPA裂解液SolarbioR0010
BCA蛋白定量试剂盒ThermoPICPI23223
PVDF膜MilliporeHATF00010
牛血清白蛋白----
抗nephrin抗体Santa Cruz BiotechnologySc-377246
抗podocin抗体AbcamAb50339
抗CD2AP抗体Cell Signaling Technology (CST)#2135
抗desmin抗体CST#4024
抗Bcl2抗体Santa Cruz BiotechnologySc-492
抗Bax抗体Santa Cruz BiotechnologySc-493
抗磷酸化AKT抗体CST#9271
抗AKT抗体CST#9272
抗磷酸化mTOR抗体CST#2974
抗mTOR抗体CST#2972
抗GAPDH抗体CST#5174
二抗Beyotime--
ECL成像系统Tanon--
Annexin V-FITC----
碘化丙啶----
Triton X-100SolarbioT8200
牛血清白蛋白SolarbioA8010
抗sC5b-9抗体Abcamab55811
抗nephrin抗体Santa Cruz Biotechnologysc-377246
抗podocin抗体Abcamab50339
二抗Beyotime--
封片剂BeyotimeP0126
乳酸脱氢酶检测试剂盒Nanjing Institute of Bioengineering--
CO2培养箱Thermo Fisher ScientificThermo Forma 3111
ABI Prism 7300ABIABI-7300

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系:MPC5小鼠足细胞;培养条件:33°C含IFN-γ,分化条件:37°C 10-14天无IFN-γ
阅读提示:Methods: Cell culture
足细胞损伤模型建立
C5b-6浓度:0.8 μg/mL;NHS稀释比例:1:80;处理时间:1小时
阅读提示:Methods: In vitro model of podocyte injury induced by the C5b-9 complex; Results: Successful modeling
药物处理
PrA和OA浓度:80 μM;LY294002浓度:5 μM;IGF-1浓度:100 ng/mL;处理时间:24小时
阅读提示:Methods: Experimental grouping; Figures 3-5
凋亡检测
Annexin V-FITC和PI双染;细胞数量:5-10百万
阅读提示:Methods: Flow cytometry (FCM) detection
蛋白表达检测
抗体稀释比例:nephrin 1:500, podocin 1:1,500, CD2AP 1:1,000, desmin 1:1,000, Bcl2 1:500, Bax 1:500, p-AKT 1:1,000, AKT 1:1,000, p-mTOR 1:1,000, mTOR 1:1,000, GAPDH 1:2,000
阅读提示:Methods: Western blot analysis