建立足细胞损伤模型
验证sC5b-9复合物能否诱导足细胞损伤并确定最佳浓度。
使用不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL)的C5b-6复合物和正常人血清(NHS)处理分化的MPC5足细胞,通过CCK-8、LDH检测和免疫荧光评估细胞活力和sC5b-9沉积。
Protosappanin-A and oleanolic acid protect injured podocytes from apoptosis through inhibition of AKT-mTOR signaling.
包含体外细胞模型、凋亡检测、基因和蛋白表达分析及信号通路验证,但缺乏体内模型和临床样本验证。
MPC5小鼠足细胞系 sC5b-9诱导的足细胞损伤体外模型
sC5b-9浓度:0.8 μg/mL PrA和OA处理浓度:80 μM IGF-1浓度:100 ng/mL LY294002浓度:5 μM C5b-6复合物与正常人血清(NHS)比例:1:80
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证sC5b-9复合物能否诱导足细胞损伤并确定最佳浓度。
使用不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL)的C5b-6复合物和正常人血清(NHS)处理分化的MPC5足细胞,通过CCK-8、LDH检测和免疫荧光评估细胞活力和sC5b-9沉积。
确定sC5b-9诱导足细胞损伤的表型变化。
用0.1和0.8 μg/mL的C5b-6处理细胞,通过流式细胞术检测凋亡,western blot和免疫荧光检测nephrin、podocin、CD2AP和desmin的表达。
确定PrA和OA的最佳保护浓度。
用不同浓度(0, 10, 20, 40, 80, 160 μM)的PrA和OA处理受损足细胞,通过CCK-8检测细胞活力。
验证PrA和OA对足细胞凋亡和分子标志物的保护作用。
受损足细胞分别用80 μM PrA、80 μM OA、两者联合或5 μM LY294002处理,通过流式细胞术、qRT-PCR和western blot检测凋亡及相关基因和蛋白表达。
确认PrA和OA对AKT-mTOR信号通路的抑制作用及其功能相关性。
用100 ng/mL IGF-1(PI3K-AKT激活剂)单独或与PrA和OA联合处理足细胞,通过流式细胞术检测凋亡,western blot检测AKT/mTOR磷酸化水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Hyclone | SH30809.01B |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 干扰素γ | Peprotech | 315-05 | |
| 模型建立 | C5b-6复合物 | Merck | 204906-50UGCN |
| 药物处理 | 原苏木素A | Biopurify | 102036-28-2 |
| 齐墩果酸 | Sigma | 42515 | |
| LY294002 | Selleck | S1105 | |
| 胰岛素样生长因子1 | Peprotech | 100-11 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测试剂盒 | Signalway Antibody LLC (SAB) | CP002 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 1596-026 |
| RT-qPCR | 逆转录酶 | Fermentas | #K1622 |
| SYBR Green PCR试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | #K0223 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | PICPI23223 | |
| PVDF膜 | Millipore | HATF00010 | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 抗nephrin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-377246 | |
| 抗podocin抗体 | Abcam | Ab50339 | |
| 抗CD2AP抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | #2135 | |
| 抗desmin抗体 | CST | #4024 | |
| 抗Bcl2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-492 | |
| 抗Bax抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-493 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | CST | #9271 | |
| 抗AKT抗体 | CST | #9272 | |
| 抗磷酸化mTOR抗体 | CST | #2974 | |
| 抗mTOR抗体 | CST | #2972 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | #5174 | |
| 二抗 | Beyotime | -- | |
| ECL成像系统 | Tanon | -- | |
| 流式分析 | Annexin V-FITC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8010 | |
| 抗sC5b-9抗体 | Abcam | ab55811 | |
| 抗nephrin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377246 | |
| 抗podocin抗体 | Abcam | ab50339 | |
| 二抗 | Beyotime | -- | |
| 封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| LDH检测 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Nanjing Institute of Bioengineering | -- |
| 细胞培养 | CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific | Thermo Forma 3111 |
| RT-qPCR | ABI Prism 7300 | ABI | ABI-7300 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系:MPC5小鼠足细胞;培养条件:33°C含IFN-γ,分化条件:37°C 10-14天无IFN-γ 阅读提示:Methods: Cell culture |
| 足细胞损伤模型建立 | C5b-6浓度:0.8 μg/mL;NHS稀释比例:1:80;处理时间:1小时 阅读提示:Methods: In vitro model of podocyte injury induced by the C5b-9 complex; Results: Successful modeling |
| 药物处理 | PrA和OA浓度:80 μM;LY294002浓度:5 μM;IGF-1浓度:100 ng/mL;处理时间:24小时 阅读提示:Methods: Experimental grouping; Figures 3-5 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC和PI双染;细胞数量:5-10百万 阅读提示:Methods: Flow cytometry (FCM) detection |
| 蛋白表达检测 | 抗体稀释比例:nephrin 1:500, podocin 1:1,500, CD2AP 1:1,000, desmin 1:1,000, Bcl2 1:500, Bax 1:500, p-AKT 1:1,000, AKT 1:1,000, p-mTOR 1:1,000, mTOR 1:1,000, GAPDH 1:2,000 阅读提示:Methods: Western blot analysis |