验证铂耐药细胞模型
比较C13K与OV2008细胞对顺铂的敏感性差异。
采用CCK-8法测定细胞IC50值。
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Jagged1/STAT3信号在铂耐药卵巢癌中的作用
Role of Jagged1/STAT3 signalling in platinum-resistant ovarian cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内裸鼠模型和临床组织样本分析，涉及功能验证和机制验证。
主要模型
铂耐药卵巢癌细胞系C13K及其亲本OV2008 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 卵巢癌患者组织样本
重点核对
细胞株：C13K（铂耐药）和OV2008（铂敏感） DDP处理浓度及IC50测定 siRNA敲低Jagged1/2序列及转染方法 裸鼠尾静脉注射细胞数（1×10^7）及分组 DAPT处理浓度范围（0-40 μmol/L）及时间
摘要
Jagged1是Notch信号通路的关键配体，在转移性前列腺癌中高表达，其在乳腺癌中的高表达与较差的生存率相关。然而，Jagged1参与铂耐药卵巢癌的机制迄今尚未完全阐明。本研究旨在探讨Jagged1在卵巢癌铂耐药中的作用及其可能机制。与铂敏感组卵巢上皮细胞癌相比，我们发现铂耐药组中Notch1、Notch2、Jagged1、STAT3和上皮间质转化（EMT）蛋白的阳性染色强度较低。DDP耐药卵巢癌细胞系（C13K）的DDP IC50高于其亲本细胞系（OV2008）（P < 0.05），并获得EMT表型和侵袭特性。抑制或敲低Jagged1表达不仅可降低其迁移和侵袭能力，还可逆转EMT，并在蛋白水平下调丝氨酸727磷酸化STAT3（pS727）的表达，但不影响总STAT3或酪氨酸705磷酸化STAT3（pY705）在C13K细胞中的表达。此外，发现Jagged1/Notch和JAK/STAT3信号通路之间的串扰参与了Jagged1促进C13K细胞EMT的过程。体内实验表明，与植入对照细胞的小鼠相比，植入敲低Jagged1的C13K细胞的小鼠肺、肝和脾中的微转移肿瘤负荷减少。所有这些结果表明，Jagged1可与JAK/STAT3通路发生串扰，并协同促进异常EMT的发生，进一步增强铂耐药卵巢癌在体内外的侵袭和迁移能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Jagged1在铂耐药卵巢癌中是否通过STAT3通路促进EMT及癌细胞侵袭迁移？
- 核心机制
- Jagged1通过与STAT3蛋白相互作用，激活STAT3信号通路（而非Jagged2），促进EMT进程，增强铂耐药卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示Jagged1敲低或DAPT抑制Notch通路可降低C13K细胞迁移侵袭、逆转EMT并下调pS727；免疫共沉淀和免疫荧光证实Jagged1与STAT3相互作用；体内裸鼠实验显示Jagged1敲低降低肺、肝、脾微转移负荷。
- 研究意义
- 揭示了Jagged1/STAT3串扰在铂耐药卵巢癌EMT中的关键作用，为靶向Jagged1或STAT3通路以克服铂耐药提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测Notch通路蛋白表达
比较Notch通路及EMT标志物在耐药与敏感细胞中的表达差异。
Western blot检测Notch1/2、cleaved Notch1/2、Jagged1、EMT相关蛋白表达。
临床样本验证蛋白表达
验证Notch通路及EMT蛋白在铂耐药与铂敏感患者组织中的表达差异。
免疫组化染色检测Notch1、Notch2、Jagged1、STAT3、EMT蛋白表达强度。
Notch通路抑制对细胞功能的影响
探究抑制Notch通路对C13K细胞增殖、迁移及侵袭的影响。
使用DAPT处理细胞，进行细胞活力、划痕愈合、Transwell迁移和侵袭实验。
3D培养观察EMT形态变化
观察C13K细胞在3D培养下的侵袭表型及DAPT处理后的变化。
在Matrigel上培养细胞形成球形结构，观察形态。
敲低Jagged1和Jagged2验证功能
确定Jagged1和Jagged2对EMT的调控作用。
siRNA转染敲低Jagged1或Jagged2，Western blot检测EMT相关蛋白。
验证Jagged1与STAT3的相互作用
探究Jagged1与STAT3是否直接结合及STAT3磷酸化变化。
Co-IP和免疫荧光实验验证物理结合，Western blot检测STAT3及磷酸化水平。
STAT3通路抑制对EMT的影响
验证抑制JAK/STAT3通路对EMT的影响。
用WP1066处理C13K细胞，Western blot检测EMT相关蛋白。
体内实验验证Jagged1敲低对肿瘤转移的影响
评估Jagged1敲低在体内对铂耐药卵巢癌细胞转移的影响。
将C13K/si-Jagged1、C13K/si-NC和C13K细胞经尾静脉注入裸鼠，观察肿瘤负荷和转移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Jenom | -- |
| 胎牛血清 | Gibco-BRL, Invitrogen Life Technologies | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| RNA干扰 | HiPerfect转染试剂 | QIAGEN | -- |
| 聚凝胺 | Santa Cruz | -- | |
| 嘌呤霉素 | Santa Cruz | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| 药物处理 | DAPT | -- | -- |
| WP1066 | -- | -- | |
| 三维培养 | 基质胶 | Corning Incorporated | 356234 |
| 划痕实验图像获取 | 倒置显微镜BX51 | Olympus Corporation | -- |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell板 | Corning Incorporated | -- |
| 免疫荧光 | CY3标记的山羊抗小鼠IgG二抗 | BOSTER Biological Technology | BA1032 |
| FITC标记的山羊抗兔IgG二抗 | BOSTER Biological Technology | BA1105 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | EMD Millipore | -- |
| HRP标记的二抗 | LICOR Biosciences | -- | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| 抗磷酸化STAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗磷酸化STAT3 (Ser727)抗体 | Cell Signaling Technology | 94994 | |
| 抗E-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 14472 | |
| 抗N-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 13116 | |
| 抗vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| 抗cleaved Notch1抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 | |
| 抗Jagged1抗体 | Abcam | ab7771 | |
| 抗Jagged2抗体 | Abcam | ab109627 | |
| 抗Notch1抗体 | Abcam | ab8925 | |
| 抗Notch2抗体 | Abcam | ab8926 | |
| 抗Twist1抗体 | Abcam | ab50581 | |
| 抗cleaved Notch2抗体 | Signalway Antibody LLC | 40517 | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| RT-PCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| 免疫组织化学 | Elivision超敏HRP免疫组化试剂盒 | Fuzhou Maxim Biotechnology Development Co., Ltd. | Kit-9921 |
| DAB显色液 | Fuzhou Maxim Biotechnology Development Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基RPMI-1640、FBS浓度10%、青霉素/链霉素浓度100 U/mL、培养条件37°C和5% CO2 阅读提示：Methods 2.2 |
| RNA干扰 | siRNA序列、转染试剂HiPerfect、转染时细胞密度5×10^4 cells/mL 阅读提示：Methods 2.3 |
| 药物处理 | DAPT浓度范围0-40 μmol/L，处理时间；WP1066浓度范围0-8 μmol/L 阅读提示：Methods 2.4, Results 3.1, 3.4 |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒、细胞接种密度5×10^4 cells/mL、孵育时间1-2小时、检测波长450 nm 阅读提示：Methods 2.4 |
| 体外迁移和侵袭实验 | Transwell板、细胞数量（迁移5×10^4，侵袭1×10^5）、上室无血清、下室含10% FBS、孵育24小时 阅读提示：Methods 2.7 |
| 3D培养 | Matrigel浓度50 μL/cm²、细胞接种5×10^3、培养时间2周 阅读提示：Methods 2.5 |
| Western blot | 一抗种类及稀释比例、二抗稀释比例1:10000、内参β-actin 阅读提示：Methods 2.9 |
| 免疫共沉淀 | 抗体：抗STAT3、抗Jagged1；蛋白A-sepharose beads 阅读提示：Methods 2.11 |
| 免疫组化 | 一抗稀释比例：STAT3 1:500, Jagged1 1:200, Notch1 1:150, Notch2 1:100 阅读提示：Methods 2.12 |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠（雌性、5周龄），每组4只，尾静脉注射1×10^7细胞 阅读提示：Methods 2.13 |