黄芩苷诱导结肠癌细胞衰老的表型验证
验证黄芩苷是否诱导结肠癌细胞衰老以及是否伴随凋亡。
用不同浓度黄芩苷处理HCT116和SW480细胞48小时，进行SA-β-Gal染色、细胞周期分析、EdU染色、集落形成实验和Annexin V/PI染色。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
黄芩苷通过上调DEPP和激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路诱导人结肠癌细胞衰老
Baicalin induces cellular senescence in human colon cancer cells via upregulation of DEPP and the activation of Ras/Raf/MEK/ERK signaling.
实验完整度
高包含体外细胞实验、缺氧模型、异种移植小鼠模型、转录组分析、功能获得/缺失验证及机制抑制剂实验。
主要模型
HCT116人结肠癌细胞系 SW480人结肠癌细胞系 A549人肺癌细胞系 Panc-1人胰腺癌细胞系 HCT116异种移植裸鼠模型
重点核对
结肠癌细胞系HCT116和SW480在体外实验中的使用 黄芩苷处理浓度：10, 20, 40 μM 体内实验中黄芩苷给药剂量：80 mg/kg，腹腔注射 细胞周期分析中S期细胞比例的变化 DEPP敲低后SA-β-Gal阳性细胞百分比的降低（从28.3%降至13.4%和11.2%）
摘要
黄芩苷是一种天然的黄酮糖苷，在癌细胞中具有有效的抗肿瘤和抗氧化活性。在本研究中，我们发现黄芩苷处理显著诱导结肠癌细胞衰老。此外，黄芩苷上调HCT116结肠癌细胞中孕激素诱导的蜕膜蛋白（DEPP）的表达，并伴随Ras/Raf/MEK/ERK和p16INK4A/Rb信号通路的激活。同时，这些现象也出现在黄芩苷的抗氧化作用之下。另外，在HCT116细胞中异位表达DEPP显著诱导肿瘤细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性，该活性受Ras/Raf/MEK/ERK信号通路调控。通过RNA干扰敲低DEPP有效抵消了黄芩苷介导的癌细胞生长抑制、衰老和细胞周期阻滞。重要的是，在人结肠癌异种移植小鼠模型中，我们进一步证实黄芩苷处理显著抑制肿瘤生长，这是由于体内通过上调DEPP和激活Ras/Raf/MEK/ERK信号诱导肿瘤细胞衰老所致。除了黄芩苷处理外，我们还发现缺氧反应蛋白DEPP作为正调控因子，参与调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路以及抑制人结肠癌的作用，其他抗氧化药物如姜黄素和萝卜硫素也能通过DEPP导致肿瘤细胞衰老。这些结果共同表明，黄芩苷通过作为抗氧化剂上调DEPP的表达并激活其下游Ras/Raf/MEK/ERK和p16INK4A/Rb通路，从而诱导结肠癌细胞衰老。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黄芩苷是否通过调节DEPP及Ras/Raf/MEK/ERK信号通路诱导结肠癌细胞衰老，并抑制肿瘤生长？
- 核心机制
- 黄芩苷通过抗氧化作用（降低ROS、升高SOD活性）上调DEPP表达，进而激活Ras/Raf/MEK/ERK和p16INK4A/Rb信号通路，诱导结肠癌细胞衰老。
- 主要证据
- 体外实验显示黄芩苷诱导HCT116和SW480细胞衰老；异种移植模型显示黄芩苷抑制肿瘤生长、增加SA-β-Gal阳性细胞和p16INK4A表达；DEPP敲低逆转这些效应，且DEPP与Ras存在物理相互作用。
- 研究意义
- 该研究确立DEPP为调控衰老诱导的关键节点，可能成为癌症治疗的新靶点，并提示抗氧化药物具有肿瘤抑制潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
黄芩苷对ROS水平和SOD活性的影响
检测黄芩苷是否通过降低ROS和增强SOD活性发挥抗氧化作用。
用黄芩苷处理HCT116和SW480细胞，检测ROS水平（DCFH-DA染色）、SOD活性以及DNA损伤标志物γH2AX和p-ATM的表达。
转录组分析及DEPP上调验证
筛选黄芩苷处理后调控的基因，尤其是缺氧反应基因，并验证DEPP的上调。
对黄芩苷处理的HCT116细胞进行全基因组微阵列分析，筛选差异表达基因，并用qRT-PCR验证DEPP的mRNA水平，同时检测缺氧条件下DEPP及Ras/Raf/MEK/ERK通路蛋白的表达。
体内异种移植模型验证肿瘤生长抑制和衰老诱导
在体内验证黄芩苷抑制肿瘤生长是否通过诱导衰老及DEPP上调。
将HCT116细胞皮下注射到裸鼠，建立异种移植模型，腹腔注射黄芩苷14天，检测肿瘤体积、体重、Ki67、SA-β-Gal、p16INK4A、cleaved-caspase 3表达及信号通路蛋白。
敲低DEPP对黄芩苷诱导衰老的影响
验证DEPP在黄芩苷诱导衰老中的功能必要性。
用siRNA敲低HCT116细胞中DEPP的表达，然后进行黄芩苷处理，检测SA-β-Gal阳性细胞比例、细胞周期分布、集落形成能力。
DEPP对信号通路和衰老的因果调控
验证DEPP是否通过激活Ras/Raf/MEK/ERK和p16INK4A/Rb通路诱导衰老。
敲低或过表达DEPP，并联合使用MEK抑制剂U0126和Raf抑制剂sorafenib或siRNA靶向Raf1和ERK，检测信号通路蛋白和衰老表型。
其他抗氧化药物对DEPP和衰老的影响
验证其他抗氧化药物（如姜黄素和萝卜硫素）是否也能通过DEPP诱导衰老。
用姜黄素和萝卜硫素处理HCT116细胞，检测SA-β-Gal活性、集落形成、EdU染色以及DEPP和相关信号蛋白的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 细胞增殖检测 | EdU染色试剂盒 | Ribobio | C10310-3 |
| 流式分析 | 细胞周期检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 流式分析 | 抗磷酸化ATM-PE抗体 | Merck Millipore | -- |
| BD FACSCalibur流式细胞仪 | BD | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA纯化 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 微阵列分析 | Quick Amp标记试剂盒（单色） | Agilent Technologies | -- |
| Agilent 4x44K全人基因组基因表达芯片 | Agilent Technologies | -- | |
| Nanodrop ND-1000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| Agilent微阵列扫描仪G2565BA | Agilent Technologies | -- | |
| qRT-PCR | QuantiFast探针RT-PCR试剂盒 | Qiagen | 204443 |
| Western blotting | 聚偏二氟乙烯膜 | Merck Millipore | IPVH00010 |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck Millipore | -- | |
| SA-β-Gal染色 | SA-β-Gal染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| 转染 | Micropoly转染试剂 | Micropoly | -- |
| 药物处理 | 黄芩苷 | Jiangsu Institute for Food and Drug Control | -- |
| 集落染色 | 结晶紫 | Nanjing Chemical Reagent Co., LTD | -- |
| Western blotting | 抗pRb抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 |
| 抗Rb抗体 | Cell Signaling Technology | 9313 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗p27抗体 | Cell Signaling Technology | 3686 | |
| 抗Ras抗体 | Cell Signaling Technology | 3339 | |
| 抗Raf1抗体 | Cell Signaling Technology | 53745 | |
| 抗p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗DEPP抗体 | Proteintech | 25833-1-AP | |
| 抗p16INK4A抗体 | SAB Signalway Antibody | 41296 | |
| 抗裂解caspase 3抗体 | SAB Signalway Antibody | 40500 | |
| 抗caspase 3抗体 | SAB Signalway Antibody | 42437 | |
| 抗β-actin抗体 | SAB Signalway Antibody | 4970 | |
| 抗p-Raf1抗体 | SAB Signalway Antibody | 11006 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | SAB Signalway Antibody | 3012 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | SAB Signalway Antibody | 3032 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Merck Millipore | AB9260 |
| SP免疫组化二抗试剂盒（兔） | MaiBio | -- | |
| 流式分析 | 抗γH2AX (S139)-PE抗体 | eBioscience | -- |
| 药物处理 | U0126 | -- | -- |
| 索拉非尼 | -- | -- | |
| 姜黄素 | -- | -- | |
| 萝卜硫素 | -- | -- | |
| 转染 | pcDNA3.1载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系、培养基（RPMI 1640）、胎牛血清浓度、抗生素浓度、培养条件（温度、CO2） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Lines and Culture |
| 药物处理 | 黄芩苷浓度（10, 20, 40 μM）和处理时间（24, 48小时） 阅读提示：Results: Baicalin-Induced Senescence in Colon Cancer Cells, Figure legends 1 |
| 动物实验 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、周龄、细胞接种量、黄芩苷剂量（80 mg/kg）、给药方式（腹腔注射）、给药时间（接种后第5天起持续14天） 阅读提示：Materials and Methods: Animal Study, Figure legend 4 |
| 基因敲低 | siRNA序列、转染试剂、转染时间、敲低效率验证 阅读提示：Materials and Methods: RNA Interference, Figure legend 5 |
| 信号通路抑制 | U0126和Sorafenib浓度、处理时间、细胞系 阅读提示：Results: Ras/Raf/MEK/ERK Signaling Pathway was Involved in DEPP-Mediated Tumor Cellular Senescence, Figure legend 7 |
| SA-β-Gal染色 | 染色试剂盒（Beyotime）、pH、固定液和染色液、显微镜观察和计数方法 阅读提示：Materials and Methods: Assessment of Senescence-Associated β-Galactosidase Activity |
| 细胞周期分析 | 固定方法（70%乙醇）、染色试剂盒（Vazyme）、流式细胞仪 阅读提示：Materials and Methods: FACS Analysis |