验证FUT8对TGEV复制的影响
确认FUT8是否为TGEV复制所必需的关键宿主因子
构建FUT8敲除的PK-15和ST细胞系，以不同MOI感染TGEV，通过IFA、WB和TCID50检测病毒N蛋白和病毒滴度；同时构建FUT1-13（除FUT6）混合敲除细胞比较各FUT成员的作用。
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FUT8介导的受体APN核心岩藻糖基化驱动多种甲型冠状病毒的入侵
FUT8-mediated core fucosylation of receptor APN drives entry of multiple alphacoronaviruses.
实验完整度
高包含基因敲除、回补突变体、抑制剂处理、SPR结合、膜融合、病毒感染、糖蛋白组学等多层级验证，且具有明确的体外细胞模型和机制研究。
主要模型
猪肾细胞系PK-15 猪睾丸细胞系ST 人胚胎肾细胞系293T 猫肾细胞系CRFK
重点核对
FUT8敲除细胞系（PK-15、ST、293T、CRFK）的构建及敲除效率验证 TGEV感染FUT8敲除细胞的病毒滴度（TCID50）和N蛋白表达检测 pAPN N736A、cAPN N747A、fAPN N740A点突变对TGEV-S、CCoV-S、FIPV-S膜融合效率的影响 SPR检测WT与FUT8-KO来源pAPN与TGEV RBD的结合动力学 糖蛋白组学分析WT与FUT8-KO细胞中pAPN N736位点核心岩藻糖基化水平
摘要
理解冠状病毒（CoVs）与其宿主之间的相互作用机制对于理解病毒复制周期和鉴定新的抗病毒靶点至关重要。在本研究中，我们发现α-(1,6)-岩藻糖基转移酶（FUT8）通过其岩藻糖基转移酶活性，参与多种甲型冠状病毒（α-CoVs）刺突蛋白与受体氨肽酶N（APN）的相互作用，从而调节病毒入侵。机制上，缺乏FUT8介导修饰的pAPN不能与传染性胃肠炎病毒（TGEV）的RBD结合。病毒入侵依赖于pAPN N736位点的核心岩藻糖基化。进一步的pAPN糖蛋白组学分析证实，N736位点的核心岩藻糖基化在野生型（WT）细胞中确实存在，但在敲除（KO）细胞中几乎完全消失，这突出表明FUT8通过介导pAPN N736的核心岩藻糖基化促进病毒入侵。有趣的是，FUT8对于犬和猫冠状病毒（它们同样使用APN作为受体）的入侵也是必需的，通过分别介导犬和猫APN上N747和N740位点的核心岩藻糖基化，表明FUT8在这些物种中具有保守的功能。总的来说，这项研究揭示了FUT8在多种α-CoVs入侵中的作用，揭示了核心岩藻糖基化在病毒复制中的重要性，并确定FUT8是一个潜在的广谱抗病毒靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FUT8及其介导的核心岩藻糖基化如何影响多种甲型冠状病毒通过受体APN的入侵？
- 核心机制
- FUT8通过其核心岩藻糖基转移酶活性，对APN受体（猪N736、犬N747、猫N740）进行核心岩藻糖基化修饰，该修饰对于病毒刺突蛋白与APN受体的结合及后续的膜融合和病毒入侵至关重要。
- 主要证据
- FUT8敲除显著抑制TGEV和FIPV感染及S蛋白介导的膜融合；SPR显示FUT8-KO来源pAPN与TGEV RBD结合消失；糖蛋白组学证实FUT8敲除几乎完全消除pAPN N736位点核心岩藻糖基化；APN糖基化位点突变（N736A/N747A/N740A）在FUT8-KO细胞中不进一步降低病毒入侵效率。
- 研究意义
- 本研究发现FUT8介导的受体APN核心岩藻糖基化是多种α-CoVs入侵的保守宿主机制，揭示了核心岩藻糖基化在病毒复制中的重要性，并指出FUT8是一个潜在的广谱抗病毒药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FUT8酶活性在TGEV感染中的作用
确定FUT8促进病毒感染是否依赖其核心岩藻糖基转移酶活性
在FUT8敲除细胞中回补野生型FUT8或无酶活突变体FUT8-R365A，或用岩藻糖基化抑制剂2F-Peracetyl-Fucose和FUT8抑制剂FDW028处理PK-15细胞，检测TGEV感染水平。
确定FUT8影响病毒感染的具体阶段
探究FUT8敲除是通过影响病毒进入还是复制阶段来抑制感染
通过透射电镜观察病毒复制结构，IFA检测dsRNA形成，BAC转染实验绕过进入步骤，以及病毒吸附和内化实验，确定FUT8的作用阶段。
验证FUT8通过修饰pAPN影响病毒进入
验证FUT8对pAPN的修饰是否是其影响TGEV进入的关键
在293T-WT和293T-FUT8 KO细胞中过表达pAPN，检测TGEV-S介导的膜融合；使用核心岩藻糖特异性凝集素AOL进行竞争抑制实验。
鉴定pAPN上FUT8介导的核心岩藻糖基化关键位点
确定pAPN上影响TGEV进入的特异性核心岩藻糖基化位点
使用SPR分析WT和FUT8-KO来源pAPN与TGEV RBD的结合；构建pAPN N736A突变体，通过流式细胞术和膜融合实验评估TGEV-S的结合和进入效率。
糖蛋白组学分析FUT8敲除对pAPN核心岩藻糖基化的影响
从分子水平证实FUT8敲除特异性消除pAPN N736位点的核心岩藻糖基化
对WT和FUT8-KO细胞中过表达的pAPN进行糖蛋白组学分析，比较N736位点核心岩藻糖基化肽段的丰度和聚糖种类。
验证FUT8在其他α-CoVs（CCoV和FIPV）入侵中的保守作用
检验FUT8介导的APN核心岩藻糖基化是否是多物种中多种α-CoVs入侵的通用机制
通过结构分析，构建cAPN N747A和fAPN N740A突变体，在293T-WT和FUT8-KO细胞中进行CCoV-S和FIPV-S膜融合实验，并在CRFK-FUT8 KO细胞中验证FIPV感染。
评估FUT8缺乏对人冠状病毒HCoV-229E感染的影响
探究FUT8介导的核心岩藻糖基化是否也影响利用同一受体的人α-CoV HCoV-229E的感染
构建FUT8敲除的Huh7细胞系，检测HCoV-229E的感染效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | BbsI限制性内切酶 | NEB | -- |
| 蛋白表达 | 无血清CD培养基 | Sino Biological | SMM 293-TI |
| TF1转染试剂 | Sino Biological | STF02 | |
| 293无血清补料 | Sino Biological | M293-SUPI-100 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | JetPRIME转染试剂 | PolyPlus | -- |
| 基因敲除细胞系构建 | pMD2.G包装质粒 | Addgene | #12259 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | #12260 | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | -- |
| SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | 抗dsRNA抗体 | SCICONS | #10010200 |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | #A-11005 | |
| Alexa Fluor 594抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | #A-11012 | |
| Alexa Fluor Plus 647山羊抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | #A32728 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma | #D9542 | |
| EVOS FL Auto荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| 脱脂奶粉 | Merck | -- | |
| 吐温-20 | Bio-rad | -- | |
| 抗His标签抗体 | Proteintech | HRP-66005 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | HRP-60008 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 山羊抗兔IgG | Abclonal | #AS014 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Beyotime | #A0216 | |
| ECL Prime蛋白质印迹检测试剂 | GE Healthcare | -- | |
| 细胞活力检测 | MTS检测试剂盒 | Abcam | #ab197010 |
| 透射电镜 | H-7650透射电子显微镜 | HITACHI | -- |
| 抑制剂处理 | 2F-全乙酰化岩藻糖 | MCE | HY-W096600 |
| FDW028 | MCE | HY-155747 | |
| 小扁豆凝集素 | Vectorlabs | L-1040-10 | |
| 流式细胞术 | StrepTactin琼脂糖高性能填料 | GE Healthcare | -- |
| HiLoad 16/60 Superdex 200分子筛层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| 糖蛋白组学 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| Strata X固相萃取柱 | -- | -- | |
| C18 Zip Tips | -- | -- | |
| Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Astral质谱仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FUT8敲除细胞系构建 | sgRNA序列、Cas9细胞系、单克隆筛选方法 阅读提示：Materials and methods: Generation of candidate gene KO cell lines |
| TGEV感染和病毒滴度检测 | TGEV毒株（WH-1）、感染复数（MOI）、感染时间点、TCID50检测方法 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and viruses, Transfection and infection |
| FUT8回补和抑制剂处理 | 回补质粒（WT和R365A突变体）、抑制剂浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction and protein, Inhibitor treatment assay |
| 病毒吸附和内化实验 | 感染复数（MOI=5）、吸附和内化的温度与时间（4°C 1小时；37°C 30分钟）、酸性PBS-HCl（pH 3.0）处理 阅读提示：Materials and methods: Virion attachment and internalization assay |
| SPR结合实验 | 重组蛋白（Fc-TGEV RBD、pAPN）的表达和纯化系统（293F细胞）、SPR实验条件 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction and protein, Results: Fig 4A |
| 膜融合实验 | 效应细胞和靶细胞转染质粒、共培养时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Membrane fusion assay |
| 糖蛋白组学分析 | 蛋白提取、酶解、糖肽富集和质谱参数 阅读提示：Materials and methods: Glycoproteomic |