建立母体肥胖模型
模拟母体肥胖，研究其对后代肾脏的影响
雌性C57BL/6J和ICR小鼠分别喂食对照饮食或高脂饮食12周，然后与雄性交配产生后代（mCD-F1和mHFD-F1），后代均喂食对照饮食。
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母体肥胖通过由20-羟基二十碳四烯酸驱动的通路诱导雄性后代肾脏中巨噬细胞向肌成纤维细胞转化
Maternal obesity induces macrophage to myofibroblast transition in kidneys of male offspring through a pathway driven by 20-hydroxyeicosatetraenoic acid.
实验完整度
高包含体外细胞共培养、BMDM、体内小鼠模型（FA和IRI）、多组学分析（snRNA-seq、snATAC-seq、代谢组学、脂质组学）及功能验证（抑制剂、基因敲低/敲除）。
主要模型
母体肥胖小鼠模型（C57BL/6J和ICR） 骨髓源性巨噬细胞（BMDM） THP-1巨噬细胞 HK2近端小管细胞系
重点核对
母体饮食：对照饮食或高脂饮食（60% kcal来自脂肪），喂养12周 子代处理：8周龄时腹腔注射叶酸（250 mg/kg）诱导急性肾损伤 20-HETE给药：50 μg/kg腹腔注射 HET0016给药：10 mg/kg腹腔注射 Ffar1抑制：DC260126（10 mg/kg）或Ffar1+/-基因型
摘要
全球超过8亿人患有慢性肾脏病（CKD）。母体肥胖已成为后代发生CKD的风险因素，但其机制仍不清楚。在本研究中，我们使用母体肥胖小鼠模型来探究巨噬细胞在子代肾脏中的参与。多组学分析显示，母体肥胖通过近端小管（PT）与巨噬细胞之间失调的串扰加速雄性后代的肾脏疾病。PT来源的20-羟基二十碳四烯酸（20-HETE）通过巨噬细胞中的Ffar1促进线粒体过度活跃和巨噬细胞向肌成纤维细胞转化（MMT）。在肥胖母亲的子代中靶向20-HETE或耗竭Ffar1可显著减轻肾脏病理。激素筛选确定3,3,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）为增强巨噬细胞中Ffar1表达的因素。机制上，T3受体（TRβ）与我们在基因上游鉴定的增强子结合，通过TRβ-P300-BRD4调控轴促进Ffar1转录。这些发现强调T3和20-HETE共同激活的MMT是肥胖母亲子代肾脏疾病的核心机制，提供了潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 母体肥胖如何增加后代肾脏疾病易感性，其机制是什么？
- 核心机制
- 母体肥胖通过PT细胞中Cyp4a10/14/31上调产生20-HETE，激活巨噬细胞Ffar1，促进OXPHOS和MMT，导致肾纤维化；T3通过TRβ-P300-BRD4轴上调Ffar1转录。
- 主要证据
- 多组学分析（snRNA-seq、snATAC-seq、代谢组学、脂质组学）显示PT中Cyp4a表达升高和20-HETE水平增加；功能验证（20-HETE给药、HET0016、DC260126、Ffar1+/-和巨噬细胞特异性敲低）证实该通路作用。
- 研究意义
- 揭示了母体肥胖影响后代肾脏疾病的新机制，为预防和治疗提供潜在靶点（如CYP4A-20-HETE-FFAR1轴和TRβ-P300-BRD4轴）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
诱导后代肾脏损伤
评估母体肥胖对后代肾脏损伤易感性的影响
8周龄雄性后代接受叶酸（FA）注射或IRI手术诱导急性肾损伤，观察肾脏功能和纤维化。
多组学分析
鉴定母体肥胖后代肾脏中关键细胞类型和分子变化
对肾脏进行单核RNA测序（snRNA-seq）、单核ATAC测序（snATAC-seq）、代谢组学和氧化脂质组学分析，鉴定差异表达基因、代谢物和染色质可及性变化。
体外共培养实验
验证PT细胞来源的20-HETE对巨噬细胞MMT的作用
使用过表达CYP4A11的HK2细胞条件培养基处理M2极化的THP-1巨噬细胞，检测纤维化标志物和线粒体功能。
体内药理抑制和遗传验证
验证20-HETE-Ffar1通路在体内对肾纤维化的必要性
用HET0016（CYP4A抑制剂）、DC260126（Ffar1抑制剂）或Ffar1+/-基因敲除小鼠处理FA诱导的损伤模型，评估肾脏病理和纤维化。
机制研究
阐明T3调控Ffar1表达的分子机制
通过CUT&Tag、ATAC-seq、Capture Hi-C、CRISPR/Cas9基因编辑等技术分析T3对FFAR1增强子区域的调控，并验证TRβ-P300-BRD4轴。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | #A5256701 |
| RPMI 1640培养基 | Sangon Biotech | #E600028 | |
| MEM培养基 | Sangon Biotech | #E600102 | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | #11330032 | |
| 胎牛血清 | Gibco | #A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | BasalMedia | #S110JV30-002-CI | |
| 细胞因子处理 | 重组巨噬细胞集落刺激因子 | BioLegend | #576404 |
| 白细胞介素-4 | Sino Biological | -- | |
| 白细胞介素-13 | Sino Biological | -- | |
| 转化生长因子-β | Sino Biological | #80116-RNAH | |
| 药物处理 | 20-羟基二十碳四烯酸 | -- | -- |
| HET0016 | -- | -- | |
| IM156 | -- | -- | |
| DC260126 | -- | -- | |
| 化合物1-850 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | MCE | #HY-18739 |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 瑞美替罗 | -- | -- | |
| JQ1 | -- | -- | |
| L002 | -- | -- | |
| 法西格利芬 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 脂联素 | -- | -- | |
| 瘦素 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | #9190 |
| RT-qPCR | HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | #R323 |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | #Q711 | |
| 免疫荧光 | 一抗：波形蛋白 | Proteintech | #10366-1-AP |
| 一抗：纤连蛋白 | Abcam | #ab2413 | |
| 一抗：III型胶原 | Proteintech | #22734-1-AP | |
| 一抗：ACTA2 | Sigma-Aldrich | #SAB5700835 | |
| 一抗：CD68 | Proteintech | #28058-1-AP | |
| 二抗：山羊抗小鼠IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | #A-11001 | |
| 二抗：驴抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | #A-21207 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 免疫组化 | VECTASTAIN ABC Elite试剂盒 | Vector Labs | #PK-4001 |
| ImmPACT DAB底物 | Vector Labs | #SK-4105 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | #11836153001 | |
| Micro BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 一抗：VCAM1 | Abcam | #ab134047 | |
| 一抗：SDHA | Proteintech | #14865-1-AP | |
| 一抗：GAPDH | Proteintech | #HRP-60004 | |
| 一抗：SDHB | Proteintech | #10620-1-AP | |
| 一抗：NDUFS3 | Proteintech | #15066-1-AP | |
| 一抗：β-肌动蛋白 | Proteintech | #HRP-60008 | |
| 一抗：FLAG | Proteintech | #66008-3-Ig | |
| 一抗：OXPHOS | Abcam | #ab110413 | |
| 一抗：CYP4A | Santa Cruz | #sc-271983 | |
| 一抗：GPR40 | Invitrogen | #PA5-75351 | |
| 二抗：DyLight 680偶联的山羊抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | #5470 | |
| 二抗：DyLight 800偶联的驴抗兔IgG | Cell Signaling Technology | #5151 | |
| 流式分析 | Live/Dead可固定活力染料780 | BD Biosciences | -- |
| PerCP-Cy5.5抗小鼠CD45 | BD | #550994 | |
| PE抗小鼠F4/80 | BD | #565410 | |
| PE-Cy7抗小鼠CD86 | BD | #560582 | |
| Alexa Fluor 647抗小鼠CD206 | BD | #565250 | |
| BV421抗小鼠Ly6G | BD | #562737 | |
| PE抗小鼠CD3ε | BioLegend | #100307 | |
| PE-Cy7抗小鼠F4/80 | BioLegend | #123113 | |
| FITC抗小鼠CD86 | BioLegend | #105005 | |
| BD LSR Fortessa X-20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 线粒体功能检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | #S0026 |
| 线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime | #C2006 | |
| 钙离子检测 | 4-AM荧光探针 | Shanghai Ma-okang | #MX4504 |
| 20-HETE定量 | Agilent 1290 Infinity II高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| Agilent 6470三重四极杆质谱仪 | Agilent | -- | |
| Phenomenex Kinetex F5色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| Phenomenex C18保护柱 | Phenomenex | -- | |
| Abcam 20-HETE ELISA试剂盒 | Abcam | #ab175817 | |
| MLBio 20-HETE ELISA试剂盒 | MLBio | #ML057413 | |
| 血清肾功能标志物 | BX-3010全自动临床生化分析仪 | Mindray | -- |
| Beyotime小鼠胱抑素C ELISA试剂盒 | Beyotime | #PC215 | |
| 细胞因子检测 | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | HUABIO | #EM0010 |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | HUABIO | #EM0001 | |
| 小鼠IL-1RA ELISA试剂盒 | WELLBIO | #EM30297M | |
| 细胞分离 | 胶原酶I | Gibco | #17018-029 |
| 抗F4/80超纯磁珠 | Miltenyi Biotec | #130-110-443 | |
| MS分选柱 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 生物素化的莲藕凝集素 | -- | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | #13778100 |
| CRISPR编辑 | FD17纳米颗粒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 母体肥胖模型 | 母体饮食类型（对照或高脂）、喂养时间（12周）、小鼠品系（C57BL/6J或ICR）、后代性别（雄性） 阅读提示：Methods: Animals |
| 急性肾损伤诱导 | FA剂量（250 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、后代年龄（8周）、检测时间点（7或14天）；IRI缺血时间（22或30分钟） 阅读提示：Methods: Animals; Figure legends 1 and 2 |
| 药物处理 | 20-HETE（50 μg/kg）、HET0016（10 mg/kg）、IM156（30 mg/kg）、DC260126（10 mg/kg）、clodronate liposomes（200 μL/72h）、1-850（5 mg/kg）的给药途径（腹腔注射）和持续时间 阅读提示：Methods: Animals; Figure legends 3,4,6,8 |
| 细胞培养和处理 | BMDM分化条件（M-CSF 20 ng/mL、7天）、M2极化（IL-4和IL-13各20 ng/mL，48小时）、TGF-β刺激（5 ng/mL，5天）；THP-1分化（PMA 100 ng/mL，24小时）、M2极化（IL-4/IL-13，48小时）、TGF-β（25 ng/mL，5天）；药物浓度（IM156 25μM、DC260126 5μM等） 阅读提示：Methods: Generation of BMDMs; Cell culture and treatment |
| 分子机制研究 | T3浓度（100 nM）、TRβ激动剂（Resmetirom）和拮抗剂（1-850）浓度、P300抑制剂L002和BRD4抑制剂JQ1的浓度、增强子删除实验所用的sgRNA序列 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment; Results section 'TRβ signaling enhances FFAR1 transcription'; Figure 7 |