基于双侧肿瘤模型区分OX40应答与不应答小鼠
建立对OX40治疗反应差异的体内模型，以比较分析肿瘤微环境差异。
在OX40人源化小鼠双侧皮下接种MC38细胞，给予低剂量OX40激动剂抗体（5 mg/kg），根据T/C%比值区分应答者（<40%）和不应答者（≥40%），切除一侧肿瘤用于scRNA-seq和流式分析，并监测对侧肿瘤。
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免疫原性细胞死亡和T细胞来源的IFN-γ引发肿瘤杀伤性巨噬细胞以增强OX40免疫治疗
Immunogenic tumor cell death and T-cell-derived IFN-γ elicit tumoricidal macrophages to potentiate OX40 immunotherapy.
实验完整度
高包含scRNA-seq、流式细胞术、体外巨噬细胞极化、多肿瘤模型体内疗效评估、细胞耗竭及基因敲除小鼠机制验证。
主要模型
MC38结肠癌小鼠模型（人源化OX40小鼠） B16黑色素瘤小鼠模型（人源化OX40小鼠） E.G7淋巴瘤小鼠模型（人源化OX40小鼠） KPC胰腺癌小鼠模型（人源化OX40小鼠）
重点核对
OX40人源化小鼠，6-8周龄雌性C57BL/6J背景 肿瘤细胞皮下接种剂量：MC38和E.G7为1×10^6，B16为5×10^5 Combo治疗：MPLA（1 μg/只）和IFN-γ（5 μg/只）瘤内注射，αOX40（2.5 mg/kg）腹腔注射 抗体治疗剂量：αOX40为5 mg/kg（响应模型评估），Combo中αOX40为2.5 mg/kg 肿瘤体积达到50-100 mm^3时开始治疗，每3天给药
摘要
Liu等人证明IFN-γ和DAMPs协同将肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为促炎性NOS2+表型，该表型与改善的OX40免疫治疗反应相关。此外，OX40激动剂介导的调节性T细胞(Treg)耗竭与这些NOS2+ TAM协同促进肿瘤根除。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- OX40激动剂抗体治疗抵抗的机制是什么，如何通过组合策略增强其抗肿瘤疗效？
- 核心机制
- CD8+ T细胞来源的IFN-γ与免疫原性细胞死亡释放的DAMPs（如TLR4配体）协同，通过TLR4信号重编程肿瘤相关巨噬细胞为NOS2+肿瘤杀伤表型；OX40抗体介导的Treg耗竭进一步促进NOS2+巨噬细胞的极化，从而增强抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- scRNA-seq和流式细胞术显示OX40应答者肿瘤中NOS2+巨噬细胞富集；体外BMDM实验证明IFN-γ与肿瘤裂解液（含DAMPs）协同上调NOS2，且依赖于TLR4信号；Combo（MPLA+IFN-γ+αOX40）在多种小鼠肿瘤模型中提高治愈率；CD8+ T细胞或巨噬细胞耗竭显著削弱Combo疗效；Nos2敲除小鼠中Combo疗效受损。
- 研究意义
- 该研究提出的Combo策略为克服OX40抗体单药治疗局限性、增强OX40靶向免疫治疗疗效提供了潜在解决方案，并强调了机制引导的化疗联合OX40治疗的临床转化潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较应答与不应答肿瘤中的免疫细胞组成和巨噬细胞状态
识别与OX40治疗反应相关的免疫细胞亚群和巨噬细胞表型。
对切除的肿瘤进行scRNA-seq和流式细胞术，分析免疫细胞亚群、T细胞活化状态及巨噬细胞M1/M2极化，并比较应答与不应答组之间的差异。
验证IFN-γ和DAMPs协同驱动NOS2+巨噬细胞极化
探究微环境中驱动NOS2+巨噬细胞分化的关键信号。
使用BMDM与活化的CD8+ T细胞上清（IFN-γ来源）和肿瘤细胞冻融裂解液（DAMPs来源）共培养，通过IFN-γ中和抗体和TLR4抑制剂（TAK242）处理，检测NOS2表达；并用MPLA和IFN-γ直接刺激BMDM验证协同作用。
评估Combo（MPLA+IFN-γ+OX40抗体）在多种肿瘤模型中的疗效
确定MPLA、IFN-γ与OX40抗体联合能否增强抗肿瘤疗效。
在MC38、B16、E.G7和KPC荷瘤人源化OX40小鼠中，给予MPLA和IFN-γ瘤内注射及OX40抗体腹腔注射，监测肿瘤生长和生存期，并评估治愈后的免疫记忆。
确定Combo疗效依赖的关键免疫细胞（CD8+ T细胞和巨噬细胞）
阐明Combo疗法抗肿瘤效应所必需的免疫细胞亚群。
通过抗体介导的细胞耗竭实验，分别清除CD8+ T细胞、NK细胞或巨噬细胞，观察对Combo疗效的影响。
验证巨噬细胞NOS2依赖性肿瘤杀伤功能
证明NOS2+巨噬细胞通过NOS2依赖机制直接杀伤肿瘤细胞。
从治疗小鼠的肿瘤或脾脏中分离巨噬细胞，与MC38肿瘤细胞共培养检测杀伤功能；使用NOS2抑制剂L-NIL处理或Nos2敲除小鼠来源的BMDM，评估NOS2在杀伤中的作用。
分析OX40抗体介导的Treg耗竭对巨噬细胞极化的影响
解析OX40抗体的Treg耗竭功能在Combo疗效中的必要性及其对巨噬细胞极化的影响。
在Fcer1g KO和FcgrIIb KO小鼠中评估Combo疗效，比较不同Fc段OX40抗体（mIgG2a vs hIgG1）联合MPLA和IFN-γ的效果，并通过体外Treg与BMDM共培养及肿瘤组织免疫荧光分析Treg对NOS2+巨噬细胞极化的影响。
探索化疗药物诱导ICD从而增强OX40抗体疗效
寻找临床可及的化疗药物以增强OX40治疗，通过促进NOS2+巨噬细胞极化。
用环磷酰胺（CTX）或5-氟尿嘧啶（5-FU）处理MC38肿瘤细胞并与BMDM共培养，检测NOS2表达；在体内将CTX或5-FU与OX40抗体联合，评估抗肿瘤疗效和肿瘤中NOS2+巨噬细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Pricella | PM150210 |
| RPMI 1640培养基 | Pricella | PM150110 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Pricella | PB180120 | |
| HEPES | Pricella | PB180325 | |
| β-巯基乙醇 | Solarbio | M8211 | |
| L-谷氨酰胺 | Pricella | PB180419 | |
| 流式细胞术 | Brilliant Violet 510™抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 103137 |
| FITC抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100204 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100540 | |
| Brilliant Violet 510™抗小鼠CD8α抗体 | Biolegend | 100751 | |
| PE/Dazzle™ 594抗小鼠IFNγ抗体 | Biolegend | 505845 | |
| Pacific Blue™抗小鼠/人CD11b抗体 | Biolegend | 101224 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠F4/80抗体 | Biolegend | 123113 | |
| PE/Dazzle™ 594抗小鼠CD206抗体 | Biolegend | 141732 | |
| TruStain FcX™抗小鼠CD16/32抗体 | Biolegend | 101320 | |
| PE抗小鼠NOS2（iNOS）抗体 | Biolegend | 696806 | |
| APC抗人/小鼠颗粒酶B抗体 | Biolegend | 372204 | |
| PE抗小鼠FOXP3抗体 | Biolegend | 126404 | |
| Brilliant Violet 605™抗小鼠Ly-6G抗体 | Biolegend | 127639 | |
| 兔抗钙网蛋白抗体 | Bioss | bs-5913R | |
| 体内耗竭 | InVivoMab抗小鼠NK1.1抗体 | BioXcell | BE0036 |
| InVivoMab抗小鼠CD8α抗体 | BioXcell | BE0004-1 | |
| InVivoMab抗小鼠CD4抗体 | BioXcell | BE0003-1 | |
| InVivoMab抗小鼠CSF1R抗体 | BioXcell | BE0213 | |
| 体外中和 | 抗小鼠IFNγ抗体 | BioXcell | BE0054 |
| scRNA-seq | TotalSeq™-C0301抗小鼠Hashtag抗体 | Biolegend | 155861 |
| TotalSeq™-C0302抗小鼠Hashtag抗体 | Biolegend | 155863 | |
| TotalSeq™-C0303抗小鼠Hashtag抗体 | Biolegend | 155865 | |
| 免疫荧光 | F4/80 (D2S9R) XP®兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 70076T |
| CD4 (D7D2Z)兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 25229T | |
| FoxP3 (D6O8R)兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 12653T | |
| iNOS (E1W4J)兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 68186 | |
| 细胞增殖标记 | eBioscience™细胞增殖染料eFluor™ 670 | Invitrogen | 65-0840 |
| 药物处理 | 瑞沙托维（TAK-242） | Selleck | S7455 |
| 肽段刺激 | OVA肽（257-264） | GenScript | RP10611 |
| 细胞因子 | 小鼠M-CSF重组蛋白 | Peprotech | 315-02-10UG |
| 缓冲液 | 细胞染色缓冲液 | Biolegend | 420201 |
| 药物处理 | MPLAs Vaccigrade | InvivoGen | vac-mpls |
| 细胞因子 | 重组小鼠IFN-γ蛋白 | Sino Biological | 50709-MNAH |
| 抑制剂 | L-NIL | MCE | HY-12116 |
| 细胞标记 | CFSE细胞分裂追踪试剂盒 | Biolegend | 423801 |
| 细胞分选 | 抗F4/80磁珠（超纯，小鼠） | Miltenyi Biotec | 130-110-443 |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ预包被ELISPOT试剂盒 | Dakewe | 221000 |
| 免疫细胞分离 | 小鼠CD45（TIL）磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-110-618 |
| 细胞制备 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| scRNA-seq | Chromium单细胞5'试剂盒（v2化学双索引） | 10x Genomics | PN-1000263 |
| RNA提取 | SPARKeasy细胞RNA试剂盒 | SparkJade Biotechnology | AC0205 |
| 肝功能检测 | 小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）ELISA试剂盒 | Jianglai Biotechnology | JL12668 |
| 小鼠天冬氨酸氨基转移酶（AST）ELISA试剂盒 | Jianglai Biotechnology | JL13392 | |
| CD8+ T细胞分选 | CD8a（Ly-2）磁珠，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-117-044 |
| CD4+ T细胞分选 | CD4（L3T4）磁珠，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-117-043 |
| cDNA合成 | HifairI第一链cDNA合成SuperMix（qPCR） | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 |
| 流式细胞术 | True-Nuclear™转录因子缓冲液套装 | Biolegend | 424401 |
| 细胞活力检测 | eBioscience™ 7-AAD活力染色液 | Invitrogen | 00-6993-50 |
| Zombie Aqua™可固定活力试剂盒 | Biolegend | 423106 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDM极化实验 | BMDM分化条件：M-CSF浓度和时间（50 ng/mL，6天）；刺激条件：MPLA 100 ng/mL和IFN-γ 20 ng/mL共24小时。 阅读提示：STAR★Methods：Generation of murine bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 和 In vitro macrophages and tumors co-culture assay |
| 动物模型和治疗方案 | 小鼠品系（OX40人源化，6-8周龄雌性）；细胞接种量（MC38 1×10^6等）；治疗时间和剂量（肿瘤体积50-100 mm^3时开始，MPLA 1 μg/只、IFN-γ 5 μg/只瘤内注射，αOX40 2.5 mg/kg腹腔注射，每3天一次）。 阅读提示：STAR★Methods：Evaluation of combo therapy efficacy in multiple humanized OX40 mouse tumor models |
| 体内耗竭实验 | 耗竭抗体种类和剂量（抗CD8α 300 μg，抗NK1.1 200 μg，抗CSF1R 500 μg）；给药时间（治疗前24小时或指定时间点）。 阅读提示：STAR★Methods：Depletion studies to determine the contribution of immune cell subsets to combo therapy efficacy |
| 体外杀伤实验 | 共培养比例和时长（效应细胞与靶细胞比例（如10:1或1×10^6巨噬细胞与1×10^5肿瘤细胞））；NOS2抑制剂L-NIL浓度（200 μM）；检测时间（36或48小时）。 阅读提示：STAR★Methods：In vitro macrophages and tumors co-culture assay |