评估IMP1088对SARS-CoV-2感染的抑制作用
确定NMT抑制对SARS-CoV-2感染的抗病毒效果和剂量-效应关系。
在A549-AT和Calu-3细胞中，以不同浓度IMP1088（62.5 nM-1 µM）处理，感染SARS-CoV-2 Wuh、Delta、Omicron等，固定并免疫染色N蛋白和dsRNA，通过高内涵成像量化感染率。
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抑制宿主N-肉豆蔻酰化通过绕过高尔基体的出芽降低SARS-CoV-2的感染性
Inhibition of host N-myristoylation compromises the infectivity of SARS-CoV-2 due to Golgi-bypassing egress.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代鼻上皮、脑类器官等多个模型，并进行了功能验证（CRISPRi敲低）和机制验证（EM、蛋白质组学、通路分析）。
主要模型
A549-AT细胞 Calu-3细胞 人原代鼻上皮细胞（气-液界面培养） 人脉络丛-皮层脑类器官（ChPCO）
重点核对
IMP1088处理浓度（0.01-1 µM）和处理时间（1.5 hbi 或 hpi） 感染复数（MOI 0.2-1）和感染时间（24-72 hpi） 细胞系类型（A549-AT, Calu-3等）和原代细胞来源 NMT1敲低效率（CRISPRi sgRNA） 病毒株（Wuh、Alpha、Delta、Omicron等）
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起了2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行，尽管已有疫苗、中和抗体和抗病毒药物，它仍然是一个全球健康问题。病毒突变的出现削弱了现有干预措施的有效性，凸显了替代性宿主导向策略的重要性。在这里，我们表明，药理学抑制或敲低宿主N-肉豆蔻酰转移酶1（NMT1）（介导蛋白质N-肉豆蔻酰化的两种人类酶之一）能显著损害SARS-CoV-2、水疱性口炎病毒（VSV）和呼吸道合胞病毒（RSV）的感染。我们展示了这种宿主导向治疗策略在多种病毒嗜性位点的抗病毒功效和安全性，包括人肺腺癌细胞系、原代鼻上皮细胞和人脉络丛-皮层脑类器官。NMT1抑制触发SARS-CoV-2子代病毒粒子通过内质网和溶酶体结构绕过高尔基体出芽的途径，导致子代病毒粒子组成和刺突蛋白成熟受损，从而损害子代病毒粒子的感染性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑制宿主N-肉豆蔻酰化是否以及如何影响SARS-CoV-2的感染性？
- 核心机制
- NMT1抑制导致内质网-高尔基体分泌途径结构破坏，使病毒粒子绕过高尔基体，通过内质网和溶酶体中间体出芽，导致S蛋白加工和掺入受损，子代病毒粒子感染性下降。
- 主要证据
- 在A549-AT、Calu-3、原代鼻上皮和脑类器官中，IMP1088显著抑制SARS-CoV-2感染；CRISPRi敲低NMT1（而非NMT2）重现抗病毒效应；电镜和免疫荧光显示ERGIC和高尔基体分散，病毒粒子与ERGIC-53、GM130共定位减少，与LAMP1共定位增加；西方 blot显示子代病毒粒子S蛋白含量和切割降低。
- 研究意义
- 该研究揭示了NMT1作为广谱抗病毒宿主靶点的潜力，支持宿主导向的抗病毒策略，可能降低病毒传播。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证IMP1088在生理相关模型中的抗病毒效果
在更接近体内的模型中验证IMP1088的抗病毒活性。
在人原代鼻上皮细胞（气-液界面培养）和人脉络丛-皮层脑类器官（ChPCO）中，用IMP1088处理并感染SARS-CoV-2 Alpha，通过免疫染色和定量分析评估感染水平。
评估IMP1088对其他RNA病毒的抗病毒谱
测试NMT抑制对VSV、RSV和SFV的抑制作用，探讨广谱抗病毒潜力。
在A549细胞中，用IMP1088处理并感染表达GFP的VSV、RSV和SFV，通过GFP荧光量化感染率。
通过CRISPRi敲低NMT1和NMT2以确定介导抗病毒效应的亚型
确定NMT1和NMT2在IMP1088抗病毒作用中的相对贡献。
用CRISPRi慢病毒载体构建NMT1或NMT2敲低的稳定A549-AT细胞系，感染SARS-CoV-2-mCherry，通过荧光成像量化感染率。
分析IMP1088对病毒进入、复制和释放的影响
确定IMP1088作用的病毒生命周期阶段。
在A549-AT细胞中，用IMP1088处理并感染SARS-CoV-2，通过qRT-PCR和western blot分析细胞内病毒RNA、释放病毒粒子RNA和蛋白组成。
检测子代病毒粒子的感染性
评估IMP1088处理是否降低释放病毒粒子的感染性。
收集DMSO或IMP1088处理细胞释放的SARS-CoV-2，通过qRT-PCR定量RNA拷贝数，感染VeroE6/TMPRSS2细胞，通过免疫染色量化感染率。
分析子代病毒粒子的蛋白组成和刺突蛋白加工
揭示感染性降低的分子机制。
纯化DMSO或IMP1088处理细胞释放的病毒粒子，通过western blot分析S、N、M蛋白水平及S蛋白切割状态，并用外源Furin处理病毒粒子后检测感染性变化。
评估IMP1088对宿主细胞分泌途径结构的影响
研究NMT抑制如何破坏内质网-高尔基体运输。
通过电子显微镜、免疫荧光和免疫电镜观察IMP1088处理后的分泌途径结构，使用GM130、ERGIC-53和钙网蛋白标记物。
分析SARS-CoV-2在NMT抑制细胞中的运输和出芽
确定NMT抑制如何改变病毒粒子的细胞内运输和出芽途径。
感染SARS-CoV-2并用IMP1088处理，通过EM和免疫荧光观察病毒粒子在ER、ERGIC、高尔基体和溶酶体中的定位，并与LAMP1共定位分析。
蛋白质组学分析宿主蛋白表达变化
鉴定NMT抑制影响的宿主蛋白和通路。
对DMSO或IMP1088处理的A549-AT细胞进行无标记质谱分析，并进行GO和GSEA富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | IMP1088 | MedChemExpress | HY-112258 |
| IMP1320 | Tocris | 8109 | |
| 甲磺酸萘莫司他 | Tocris | 3081 | |
| 二甲磺酸阿吡莫德 | Tocris | 7283 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140079 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| GlutaMAX | Gibco | -- | |
| PneumaCult-Ex Plus培养基 | STEMCELL Technologies | 05040 | |
| PneumaCult-ALI-S培养基 | STEMCELL Technologies | 05050 | |
| mTeSR Plus | STEMCELL Technologies | 100-1130 | |
| 基质胶 | STEMCELL Technologies | 354277 | |
| 分散酶 | STEMCELL Technologies | 07913 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | R&D Systems | 233-FB-01M | |
| 骨形态发生蛋白4 | PeproGMP | 120-05ET-50UG | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 21103049 | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502048 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| scRNA-seq | 木瓜蛋白酶解离试剂盒 | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 |
| HIVE单细胞RNA测序试剂盒 | Perkin Elmer | -- | |
| NovaSeq 6000 SP试剂盒v1.5 | Illumina | 20028401 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine LTX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15338100 |
| 病毒检测 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | Merck | X100 |
| Hoechst 33342 | Abcam | AB228551 | |
| 鬼笔环肽 | Invitrogen | A12379 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Western blot | Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 |
| Precision Plus蛋白质标准品 | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 1620177 | |
| qRT-PCR | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | 52904 |
| TaqMan Fast Virus 1步法预混液 | Applied Biosystems | 4444432 | |
| 测序 | LunaScript RT SuperMix试剂盒 | New England Biolabs | E3010 |
| Artic V5.3.2 NCoV-2019引物 | Integrated DNA Technologies | 10011442 | |
| Q5热启动高保真PCR试剂盒 | New England Biolabs | E0555S | |
| NEBNext Ultra II FS DNA文库试剂盒 | New England Biolabs | E7805S | |
| MiSeq v3测序试剂盒 | Illumina | MS-102-3001 | |
| 蛋白质组学 | S-Trap微量离心柱 | ProtiFi | C002-MICRO-0010 |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5117 | |
| Acclaim PepMap C18 HPLC捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ultimate UHPLC 3000 RSLCnano系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FAIMS Pro接口 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 电子显微镜 | 醋酸铀 | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
| LX-112树脂 | Ladd Research Industries | 21310 | |
| JEM-1101透射电镜 | JEOL | -- | |
| Morada CCD相机 | Olympus | -- | |
| 电子断层扫描 | FEI Tecnai F30 S/TEM透射电镜 | FEI | -- |
| OneView CMOS相机 | Gatan | -- | |
| 免疫电镜 | 皂苷 | Sigma-Aldrich | 84510 |
| Nanogold偶联二抗 | Nanoprobes | 2001 | |
| 金增强EM试剂盒 | Nanoprobes | 2113 | |
| 细胞处理 | 布雷菲德菌素A | Sigma-Aldrich | B6542 |
| 4OH-达纳索 | Merck | D7693 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 7-羟基星形孢菌素（UCN-01） | Merck | 539644 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| 免疫荧光染色 | ProLong Gold防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P10144 |
| ProLong Diamond防淬灭封片剂 | Invitrogen | P363961 | |
| 组织学 | 伊红 | Merck | 17372-87-1 |
| Ultramount封片剂 | Agilent Technologies | S1964 | |
| qRT-PCR | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Mx3005P QPCR系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞培养 | ZymoPure II质粒大提试剂盒 | Zymo Research | D4203 |
| FastDigest Esp3I限制酶 | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | |
| NEB稳定感受态大肠杆菌 | New England Biolabs | C3040I | |
| 细胞处理 | 弗林蛋白酶 | New England Biolabs | P8077L |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞类型 (A549-AT, Calu-3, 原代鼻上皮等)，培养条件 (培养基、血清浓度、抗生素) 阅读提示：Methods - Cell lines, Human pseudostratified mucociliary nasal epithelial cell seeding |
| 药物处理 | IMP1088浓度 (62.5 nM-10 µM)，处理时间 (1.5 hbi, 1.5 hpi, 2 hbi等) 和是否洗涤 阅读提示：Methods - SARS-CoV-2 production, purification and infection; Figure legends (Fig. 1, 3) |
| 病毒感染 | 病毒株 (Wuh, Alpha, Delta, Omicron等)，MOI (0.2, 0.5, 1等)，感染时间 (24-72 hpi) 阅读提示：Methods - SARS-CoV-2 production, purification and infection; Figure legends (Fig. 1, 3) |
| 感染定量 | 固定和染色 (N蛋白, dsRNA等)，高内涵成像参数，图像分析软件 (CellProfiler) 阅读提示：Methods - Immunofluorescence staining, High-throughput imaging and automated image analysis |
| RNA分析 | RNA提取试剂盒，qRT-PCR引物 (RdRp)，循环条件 阅读提示：Methods - qRT-PCR |
| 蛋白质分析 | 抗体 (抗S, N, M, NMT1, NMT2)，蛋白样品制备和转膜条件 阅读提示：Methods - Western blot |