构建和表征mRNA疫苗
评估编码E2-ECD、E2-ECD-N和E2-ECD-C的mRNA在细胞中的表达和分泌情况，并选择候选抗原。
将编码E2-ECD、E2-ECD-N和E2-ECD-C的mRNA转染HEK293T细胞，通过免疫印迹检测细胞裂解物和上清中的蛋白表达。随后将E2-ECD和E2-ECD-N的mRNA包封在LNP中，并表征颗粒大小和包封率。
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编码古典猪瘟病毒E2-ECD的单剂量mRNA疫苗在兔子中诱导持久的保护性免疫
A single-dose mRNA vaccine encoding the classical swine fever virus E2-ECD induces durable protective immunity in rabbits.
实验完整度
高文献包含体外表达与表征、小鼠免疫原性(体液和细胞免疫)及兔子攻毒保护实验等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制相关验证。
主要模型
BALB/c小鼠 新西兰白兔 HEK293T细胞 PK-15细胞
重点核对
小鼠：BALB/c，6周龄，每组5或7只，单次或两次肌肉注射0.5或5 μg mRNA-LNP，对照为PBS 兔子：新西兰白兔，约2.5 kg，每组4或5只，皮下注射100 μg mRNA-LNP，对照为PBS 攻毒模型：兔经耳缘静脉注射100 RID CSFV C株，观察4天发热及病毒载量 免疫方案：单次或初免-加强(间隔14天)，血清采集时间点如第14、21、28天等 中和抗体检测：使用100 TCID50 CSFV Thiverval株( AV65 )中和，计算NT50 细胞免疫检测：脾细胞或外周血淋巴细胞用E2-ECD蛋白刺激，ICS、ELISpot和ELISA检测IFN-γ与IL-2
摘要
古典猪瘟病毒(CSFV)在家猪和野猪群体中传播，给养猪业造成重大经济损失。尽管全球广泛使用减毒活疫苗，CSFV仍然是一个持续的威胁，每年都有零星暴发。目前疫苗的主要局限是安全性问题和无法区分感染与疫苗接种动物(DIVA)。开发符合DIVA要求的疫苗对于有效控制或扑灭古典猪瘟(CSF)是可取的。在此，我们开发了两种脂质纳米颗粒(LNP)包裹的mRNA疫苗，分别编码CSFV包膜蛋白E2的胞外域(E2-ECD)或其N端172个氨基酸片段(E2-ECD-N)。小鼠免疫学检测显示，单剂量E2-ECD或E2-ECD-N mRNA疫苗均具有高抗原性和持久的保护性抗体反应。值得注意的是，E2-ECD和E2-ECD-N mRNA疫苗均在小鼠中诱导了强T细胞反应。此外，单剂量(100 μg)的E2-ECD mRNA疫苗足以在兔子中诱导针对CSFV感染的长期(长达4个月)保护性免疫。我们的发现突出了基于CSFV-E2的mRNA疫苗作为有效CSF防控并实现DIVA的有前景策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种安全、高效且符合DIVA的CSFV疫苗，并评估基于mRNA的E2疫苗在动物模型中的免疫原性和保护效果。
- 核心机制
- E2-ECD mRNA疫苗通过诱导高水平的E2特异性抗体和Th1型细胞免疫反应(IFN-γ和IL-2)提供保护，且抗体在长期保护中起主导作用。
- 主要证据
- 小鼠和兔子模型中，单剂量E2-ECD mRNA-LNP诱导强体液和细胞免疫反应，并在兔子攻毒实验中提供完全保护(无发热、脾脏病毒RNA不可检测)。
- 研究意义
- 研究表明E2-ECD和E2-ECD-N mRNA疫苗可作为潜在DIVA疫苗防治CSFV，并为开发针对其他猪病原体的多价mRNA疫苗奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫原性评估
检测E2-ECD和E2-ECD-N mRNA-LNP疫苗在小鼠中诱导的体液和细胞免疫反应。
BALB/c小鼠分别接受单次或初免-加强免疫，剂量0.5或5 μg，通过ELISA检测E2特异性抗体效价，并在单次免疫后第10天通过ICS、ELISpot和ELISA检测脾细胞中IFN-γ和IL-2的产生。
小鼠长期抗体反应评估
评估单次免疫后小鼠E2特异性抗体的持续时间。
BALB/c小鼠单次免疫0.5或5 μg mRNA-LNP，定期采血至24周，通过ELISA检测E2抗体效价。
兔子免疫原性和攻毒保护实验
评估单剂量E2-ECD和E2-ECD-N mRNA-LNP在兔子中的免疫原性和对CSFV攻毒的保护效果。
新西兰白兔单次皮下免疫100 μg mRNA-LNP，在第14、21、28天采血检测E2和Erns抗体及中和抗体，第31天用CSFV C株攻毒，观察4天发热、脾脏异常并检测病毒RNA。
兔子长期保护实验
评估单剂量E2-ECD mRNA-LNP在兔子中提供的保护性免疫持续时间。
新西兰白兔单次皮下免疫100 μg E2-ECD mRNA-LNP，定期采血至18周，第18周用CSFV C株攻毒，观察发热和病毒载量。同时监测外周血淋巴细胞中IFN-γ产生T细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | #C11875500BT |
| 胎牛血清 | CellMax | #SA211.02 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | #15140-122 | |
| SMM 293-TII表达培养基 | SinoBiological | -- | |
| 体外转录 | HiScribe T7 mRNA试剂盒（含CleanCap Reagent AG） | New England Biolabs | #E2080L |
| 无RNase的DNase I | Promega | #M6101 | |
| mRNA纯化 | Monarch RNA纯化试剂盒 | New England Biolab | #T2050L |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | #52887 |
| 免疫印迹 | HRP标记的6*His抗体 | Proteintech | #HRP-66005 |
| 抗GFP抗体 | GeneTex | #GTX113617 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | #111-035-003 | |
| LNP制备 | Amicon超滤离心管 | Millipore | -- |
| LNP表征 | Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒 | Invitrogen | #R11490 |
| 马尔文Nano ZS90 | Malvern | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni Sepharose高性能组氨酸标签蛋白纯化树脂 | Cytiva | #17526801 |
| 胶体蓝染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| ELISA | 96孔平底微量滴定板 | Corning | 655061 |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| 酶标仪（SpectraMax i3x多功能酶标仪） | Molecular Devices | -- | |
| Erns抗原 | COIBO BIO | CB10746-Pg | |
| 细胞因子检测 | IL-2 ELISA试剂盒 | BioLegend | 575409 |
| IL-4 ELISA试剂盒 | BioLegend | 431101 | |
| 流式分析 | 抗CD3-PB抗体 | BioLegend | #100214 |
| 抗CD4-FITC抗体 | BD | #553046 | |
| 抗CD8-PerCP-Cy5.5抗体 | BD | #553036 | |
| IFN-γ-APC抗体 | Invitrogen | #17-7311-82 | |
| IL-2-PE抗体 | BioLegend | #503808 | |
| ELISpot | IFN-γ ELISpot试剂盒 | Mabtech | 3321-4AST-2 |
| IL-2 ELISpot试剂盒 | Mabtech | 3441-4HPW-10 | |
| qPCR | RNAiso Plus试剂 | Takara | 9108Q |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HEK293T和PK-15细胞培养条件：DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素；Expi293F细胞悬浮培养于SMM 293-TII培养基，37°C，8% CO2，95 rpm 阅读提示：Materials and methods中的Cells and viruses |
| mRNA体外转录 | 使用HiScribe T7 mRNA Kit（含CleanCap Reagent AG）加帽；DNase I处理去除DNA模板；Monarch RNA Cleanup Kit纯化 阅读提示：Materials and methods中的In vitro transcription (IVT) |
| LNP制备与表征 | 脂质混合物含SM102、DSPC、胆固醇、DMG-PEG 2000；mRNA与脂质在乙醇中按3:1体积比混合；透析至PBS；包封率>90%；粒径约75 nm，PDI<0.1 阅读提示：Materials and methods中的LNP encapsulation and characterization |
| 小鼠免疫 | BALB/c小鼠，6周龄；单次或初免-加强（间隔14天）；肌肉注射0.5或5 μg mRNA-LNP；对照PBS；血清采集时间点（第28天等） 阅读提示：Materials and methods中的Immunizations of mice |
| 小鼠细胞免疫检测 | 脾细胞于免疫后第10天分离；用E2-ECD蛋白刺激（ICS: 100 μg/mL, 48h；ELISpot: 30 μg/mL, 36h；ELISA: 30 μg/mL, 72h） 阅读提示：Materials and methods中的Intracellular cytokine staining (ICS) and flow cytometry analysis、Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay、ELISA |
| 兔子免疫与攻毒 | 新西兰白兔，约2.5 kg；皮下注射100 μg mRNA-LNP；攻毒剂量100 RID CSFV C株；耳缘静脉注射；观察4天发热（≥40°C持续≥24h）；脾脏病毒RNA检测 阅读提示：Materials and methods中的Immunizations and challenge of rabbits |
| 中和抗体检测 | 血清热灭活（56°C, 30min）；与100 TCID50 CSFV Thiverval株（AV65）孵育1h；加入PK-15细胞，培养7h；RT-qPCR定量病毒RNA；NT50计算 阅读提示：Materials and methods中的Virus neutralization assay |
| ELISA检测 | 包被抗原E2-ECD（2 μg/mL）或Erns（COIBO BIO）；血清稀释；检测抗体HRP-抗小鼠或抗兔IgG；TMB显色；读取450-570nm 阅读提示：Materials and methods中的Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |