hTET2-CS蛋白表达与纯化
获得高纯度且具有活性的TET蛋白用于后续氧化反应。
培养293F细胞，转染pB-CMV-Strep-Tag II-hTET2-CS质粒，纯化hTET2-CS蛋白，并通过SDS-PAGE和LC-MS/MS验证活性。
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使用m5C-TAC-seq在碱基分辨率下分析RNA m5C甲基化的方案
Protocol for profiling RNA m5C methylation at base resolution using m5C-TAC-seq.
实验完整度
高包含蛋白纯化、体外氧化、标记、下拉、文库构建及生信分析，并通过LC-MS/MS和Sanger测序验证，具备多层级实验验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（mESC） 293F细胞 NNm5CNNNN刺突RNA
重点核对
hTET2-CS蛋白氧化效率需达50% AI标记效率约99% 使用Input对照以排除假阳性 文库构建需用至少100 ng RNA起始 测序深度推荐15-20 G（m5C-TAC样本）
摘要
RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种广泛存在的修饰，在基因表达调控中起着至关重要的作用。在此，我们提出了一种利用TET辅助的化学标记测序（m5C-TAC-seq）的无亚硫酸盐m5C检测策略，实现转录组范围内碱基分辨率的m5C甲基化谱分析方案。我们详细介绍了TET辅助化学标记、文库构建和数据分析的步骤。m5C-TAC-seq能够在各种RNA种类中实现准确而稳健的m5C检测。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现碱基分辨率的转录组范围m5C检测？
- 核心机制
- TET氧化m5C为f5C，AI标记后生物素富集，反转录时诱导C-to-T转换。
- 主要证据
- 在mESC中鉴定664个高可信m5C位点，且通过多种酶敲除后信号消失，证实位点可信性。
- 研究意义
- 提供无亚硫酸盐、碱基分辨率的m5C检测方案，可应用于多种RNA种类，并研究m5C动态变化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA样本制备
获取高质量、适当片段的RNA用于后续标记。
培养mESC并诱导分化，提取总RNA，DNase处理，纯化，polyA富集，片段化。
TET辅助化学标记
将m5C氧化为f5C，并用AI标记，以便富集和检测。
对RNA进行hTET2-CS氧化，PNK处理，连接3'接头，AI标记，点击化学反应，生物素下拉。
文库构建
将标记的RNA转化为可测序的DNA文库。
逆转录，连接5'接头，PCR扩增，纯化，PAGE胶回收。
生物信息学分析
识别RNA上的m5C位点。
对测序数据进行质量控制，比对到参考基因组，过滤比对结果，解析C-to-T转换，调用m5C位点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | SMM 293-TI培养基 | Sino Biological | Cat#M293TII |
| PEI 40K转染试剂 | Servicebio | Cat#G1802 | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin Sepharose树脂 | IBA Lifesciences | Cat#2-1201-010 |
| D-脱硫生物素 | IBA Lifesciences | Cat#2-1000-002 | |
| 30 kDa分子量截留离心浓缩器 | Amicon Ultra | Cat#UFC9030 | |
| RNA提取 | RNA Isolater总RNA提取试剂 | Vazyme | Cat#R401-01 |
| 氯仿 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | Cat#10006818 | |
| RNA处理 | 无RNA酶的DNase I | Vazyme | Cat#EN401-01 |
| RNA纯化 | RNA Clean & Concentrator-25试剂盒 | Zymo Research | Cat#R1018 |
| Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Cat#61006 | |
| RNA片段化 | NEBNext镁RNA片段化模块 | NEB | Cat#E6150S |
| 化学标记 | 1,3-茚二酮叠氮衍生物（AI） | -- | -- |
| DBCO-S-S-PEG3-生物素 | Click Chemistry Tools | Cat#A112-10 | |
| 下拉 | BeyoMag链霉亲和素磁珠 | Beyotime | Cat#P2151 |
| 文库构建 | HiScript III RT SuperMix | Vazyme | Cat#R323-01 |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | Cat#KR0370 | |
| T4 RNA连接酶2（截短） | Beyotime | Cat#R0635L | |
| 高浓度T4 RNA连接酶1 | NEB | Cat#M0437M | |
| 5'脱腺苷酸酶 | NEB | Cat#M0331S | |
| RecJf核酸外切酶 | NEB | Cat#M0264S | |
| 大肠杆菌核酸外切酶I | NEB | Cat#M0293S | |
| Dynabeads MyOne硅烷磁珠 | Thermo Fisher Scientific | Cat#37002D | |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | Cat#N411 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | Cat#C11965500BT |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | Cat#15140-122 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | Cat#11140050 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | Cat#25030081 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | 293F细胞密度需1×10^6至3×10^6 cells/mL；转染后72小时收集；梯度盐洗浓度序列。 阅读提示：Before you begin, step 2-3 |
| RNA制备 | 总RNA完整性（RIN>9或28S:18S≈2:1）；DNase处理条件；polyA富集需两轮；RNA片段化时间（m5C-TAC组94°C 3分钟，Input组5分钟）。 阅读提示：Before you begin, steps 4-10 |
| TET辅助化学标记 | 氧化反应体系组成（MES, NaCl, DTT, L-aa, 2-KG, (NH4)2Fe(SO4)2, RNase inhibitor, spike-in RNA, hTET2-CS）；氧化条件37°C 2小时；AI标记条件37°C 850 rpm 24小时。 阅读提示：Step-by-step method details, step 1 and 4 |
| 生物素下拉 | 磁珠用量20 μL；结合缓冲液（0.5×SSC, 1% SDS）；封阻用酵母tRNA（20 μg）；洗涤次数6次。 阅读提示：Step-by-step method details, step 6 |
| 文库构建 | 逆转录引物浓度2 μM；逆转录条件42°C 1h + 50°C 1h；PCR循环数15-18；PAGE胶片段范围170-300 bp。 阅读提示：Step-by-step method details, steps 7-9 |
| 测序及生物信息学分析 | 测序深度（m5C-TAC 15-20 G，Input 5-10 G）；比对参数（HISAT-3N设置base-change C,T）；过滤条件（超过3个C-to-T错配去除）。 阅读提示：Step-by-step method details, steps 10-12 |