预测刺突蛋白SH三聚体结构
确定S2亚基中SH区域的结构特征，为后续突变分析提供结构基础。
使用AlphaFold 3预测刺突蛋白残基1135-1273的结构，并与预融合结构（PDB ID: 6XR8）进行比对，定义了SH区域（残基1140-1211）。
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F1148疏水锁：通过3H/CH腔决定SARS-CoV-2刺突蛋白介导的膜融合的关键决定因素
The F1148 hydrophobic lock: A critical determinant of SARS-CoV-2 spike protein-mediated membrane fusion via the 3H/CH cavity.
实验完整度
高包含SC2-VLP感染、定点突变、深度突变扫描、细胞-细胞融合、ACE2结合、中和实验及结构分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 SARS-CoV-2病毒样颗粒（SC2-VLP） HEK293T-ACE2&TMPRSS2细胞
重点核对
F1148残基的疏水性对膜融合至关重要 3H/CH腔的完整性（I742、C749、I993、L996、I997） HA替换突变对中和敏感性的影响 ACE2结合与膜融合的区分 SC2-VLP感染效率的检测
摘要
冠状病毒刺突蛋白的S2亚基在病毒进入过程中经历广泛的构象重折叠以驱动膜融合。尽管HR1/HR2六螺旋束（6-HB）被认为是融合的核心介导物，但其形成的分子驱动力仍不清楚。在这里，通过对AlphaFold预测的S2中茎螺旋（SH）区域进行系统突变，并分析所得SC2-VLP进入表型，我们鉴定了在融合前和融合后刺突构象中均存在的保守螺旋内的关键氨基酸残基。我们将这些元件称为融合后保留螺旋（PFPH），发现它们对SC2-VLP进入至关重要。结构分析揭示了F1148（位于PFPH-1）与由3H（I742，C749）/CH（I993，L996，I997）形成的保守腔之间的“疏水锁”相互作用。深度突变扫描表明，只有F1148处的疏水残基在功能上可行且对膜融合至关重要，强调了F1148与3H/CH腔之间的疏水锁（“hydrolock”）相互作用在膜融合中的关键作用。此外，HA替换突变和抗HA中和试验表明，显著的中和活性仅限于靠近PFPH-1的HA插入，选择性抑制膜融合而不影响受体结合。值得注意的是，3H/CH腔在刺突构象中保持结构稳定，依次被融合前L977、中间F782和融合后F1148占据。我们提出了一个模型，其中疏水锁相互作用通过置换中间相互作用驱动S2重折叠和融合。这项研究为刺突动力学提供了机制见解，并强调疏水锁相互作用是广谱抗病毒策略的有希望的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2刺突蛋白S2亚基中SH区域如何驱动膜融合？具体而言，F1148及其形成的疏水锁相互作用是否为膜融合的关键决定因素？
- 核心机制
- F1148与由3H（I742，C749）和CH（I993，L996，I997）形成的疏水腔之间的疏水锁（hydrolock）相互作用驱动S2重折叠和膜融合，通过依次置换中间相互作用（L977、F782）来完成融合过程。
- 主要证据
- 通过SC2-VLP感染实验证明F1148疏水突变严重损害病毒进入；深度突变扫描显示只有疏水残基在F1148位点可行；细胞-细胞融合实验证实疏水突变严重损害膜融合；ACE2结合实验显示这些突变不影响受体结合。
- 研究意义
- 本研究为刺突蛋白动力学提供了机制见解，并强调疏水锁相互作用是开发广谱抗病毒策略的有希望的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化SC2-VLP系统
建立用于评估刺突蛋白突变对病毒进入影响的可靠实验系统。
通过均匀设计优化S、M/E、N和Fluc-PS9质粒的转染比例，并引入HA标签用于检测，确保SC2-VLP感染效率。
SH区域丙氨酸扫描突变
鉴定SH区域中对SC2-VLP进入至关重要的氨基酸残基。
对SH区域（残基1140-1211）及其N端延伸（残基1123-1139）进行连续三丙氨酸扫描突变，评估突变体的感染效率。
F1148深度突变扫描和功能验证
验证F1148残基的疏水性对膜融合的关键作用。
对F1148位点进行深度突变扫描，将F1148替换为其他19种氨基酸，评估突变体感染效率、ACE2结合和膜融合效率。
3H/CH腔关键残基突变
验证3H/CH腔的完整性对病毒进入和膜融合的必要性。
对3H/CH腔的关键疏水残基（I993、L996、I997）以及3H中的二硫键（C738-C760，C743-C749）进行突变，评估感染性和SC2-VLP组装。
HA替换突变和中和实验
定位SH区域中抗体介导中和的敏感区域，并验证其是否通过抑制膜融合发挥作用。
将SH区域每个9残基片段替换为HA表位，用抗HA单抗进行中和实验，并通过ACE2结合和膜融合实验确定抑制机制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Biological Industries | -- | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | -- | |
| 质粒构建 | Hieff Clone Plus一步克隆试剂盒 | Yeasen | -- |
| 转染 | PEI转染试剂 | Yeasen | 40816ES01 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| SC2-VLP生产 | 0.45微米滤膜 | Millex | -- |
| Western blotting | 抗HA兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | #3724 |
| 抗SARS-CoV-2刺突RBD兔单克隆抗体 | GeneTex | GTX635692 | |
| 抗SARS-CoV-2刺突S2小鼠单克隆抗体 | GeneTex | GTX632604 | |
| 抗SARS-CoV-2核衣壳兔单克隆抗体 | GeneTex | GTX635679 | |
| 抗SARS-CoV-2膜兔单克隆抗体 | GeneTex | GTX636245 | |
| 抗SARS-CoV-2包膜兔单克隆抗体 | GeneTex | GTX136046 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A1978 | |
| HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | #7074 | |
| Western Lightning Super ECL检测试剂 | Yeasen | 36208ES | |
| 免疫沉淀 | 抗HA磁珠 | Thermo | 88837 |
| 中和实验 | XG005中和抗体 | -- | -- |
| LongHR2_42多肽 | GL Biochem | -- | |
| ELISA | SARS-CoV-2刺突RBD ELISA试剂盒 | Sino Biological | KIT40592 |
| 流式细胞术 | Attune NxT流式细胞仪 | Invitrogen | -- |
| 荧光成像 | EVOS M5000荧光显微镜 | Invitrogen | -- |
| 荧光素酶检测 | GLOMX发光检测仪 | Promega | -- |
| 萤火虫荧光素酶底物 | Promega | -- | |
| 高斯荧光素酶底物 | Promega | -- | |
| 被动裂解缓冲液 | Promega | -- | |
| 结构分析 | AlphaFold 3 | -- | -- |
| UCSF ChimeraX | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SC2-VLP生产 | 质粒转染比例（S:0.0192μg，M-E:1.96μg，N·S202R:0.92μg，Fluc-PS9:1.12μg），细胞密度（1.125×10^6），转染试剂（PEI），72小时收集上清 阅读提示：Materials and methods: SC2-VLP production |
| SC2-VLP感染 | 受体细胞HEK293T-ACE2&TMPRSS2的构建（质粒比例1:1），感染细胞密度（1.5×10^4/孔），感染后24小时检测 阅读提示：Materials and methods: SC2-VLP infection |
| 丙氨酸扫描突变 | 突变位点（Mut2:1126-1128，Mut3:1129-1131，Mut9:1147-1149，Mut22:1185-1187），感染效率检测 阅读提示：Results: Mutagenesis of the Spike SH by Alanine scanning; Figure 2 |
| F1148深度突变扫描 | F1148替换为其他19种氨基酸，感染效率、ACE2结合和膜融合检测 阅读提示：Results: Identification of a hydrophobic lock...; Figure 3 |
| Spike-ACE2结合实验 | ACE2-GFP-Fc融合蛋白的产生（转染4μg质粒，48小时收集），Spike表达（0.25μg质粒，24小时），4℃孵育2小时 阅读提示：Materials and methods: Spike-ACE2 binding assay |
| 细胞-细胞膜融合实验 | 供体细胞（Spike和C-Cfa-C-Gluc-Venus共转染），受体细胞（ACE2、TMPRSS2和N-Venus-N-Gluc-Cfa共转染），共培养1:1比例，24小时检测 阅读提示：Materials and methods: Cell-cell membrane fusion assay |
| 中和实验 | 抗HA单抗浓度（5倍系列稀释），SC2-VLP与抗体37℃孵育1小时，感染后24小时检测IC50 阅读提示：Materials and methods: Neutralization assay |