HMGB1与SARS-CoV-2刺突蛋白的相互作用
验证HMGB1是否与SARS-CoV-2刺突蛋白直接结合。
纯化HMGB1全长及各结构域，使用SPR分析结合亲和力；免疫共沉淀验证与S1亚基的结合。
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HMGB1与SARS-CoV-2的直接相互作用通过RAGE依赖性内吞作用促进其感染
Direct interaction of HMGB1 with SARS-CoV-2 facilitates its infection via RAGE-dependent endocytosis.
实验完整度
高包含体外SPR、免疫共沉淀、感染实验、RAGE阻断、内吞抑制实验和体内小鼠模型等多层级验证。
主要模型
A549细胞 NCI-H1975细胞 BALB/c小鼠感染模型
重点核对
HMGB1与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的KD值及结合位点 ACE2表达水平及RAGE表达水平 sRAGE和azeliragon对HMGB1增强感染的影响 内吞抑制剂（dynasore和氯喹）对病毒进入的作用 小鼠模型中HMGB1剂量（2和20 μg/mL）对病毒滴度和病理的影响
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是2019冠状病毒病（COVID-19）的病原体，自2020年以来已导致超过7.7亿人感染。SARS-CoV-2的结局在很大程度上受宿主免疫应答的影响。在先天免疫的关键介质中，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）因其在SARS-CoV-2感染期间炎症中的作用而受到关注，其在急性和COVID-19后病例中水平显著升高，并与疾病严重程度相关。本研究探讨了HMGB1在COVID-19发病机制中的作用。我们的研究结果表明，SARS-CoV-2刺突蛋白直接与HMGB1相互作用，形成HMGB1–SARS-CoV-2复合物。该复合物与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）相互作用，促进网格蛋白介导的内吞作用，并在体外人类肺细胞和小鼠感染模型中增强SARS-CoV-2感染。总之，本研究证明了HMGB1通过RAGE促进病毒进入的作用，强调了其作为重症COVID-19病例潜在治疗靶点的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探讨HMGB1在SARS-CoV-2感染中的具体作用，特别是其是否通过RAGE相互作用促进病毒进入。
- 核心机制
- SARS-CoV-2刺突蛋白与HMGB1直接结合形成复合物，该复合物通过RAGE介导的网格蛋白依赖性内吞作用增强病毒进入宿主细胞。
- 主要证据
- SPR和免疫共沉淀证实HMGB1与刺突蛋白结合；感染实验中HMGB1存在时病毒载量增加；sRAGE和azeliragon阻断RAGE后感染减弱；dynasore和氯喹抑制内吞后感染降低；小鼠模型中HMGB1增强病毒滴度和组织病理。
- 研究意义
- HMGB1可能作为重症COVID-19的治疗靶点，尤其适用于HMGB1水平较高的患者，为预防长期并发症提供可能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HMGB1对病毒感染性的影响
检测HMGB1是否增强SARS-CoV-2感染性。
在A549细胞中，将SARS-CoV-2与HMGB1预孵育后感染，通过western blot和qRT-PCR检测病毒载量；使用HMGB1结构域突变体比较感染性差异。
RAGE依赖性验证
验证HMGB1增强的感染是否依赖于RAGE而非ACE2。
使用shRNA敲低ACE2、sRAGE和azeliragon阻断RAGE，检测感染变化；使用假病毒验证。
内吞机制研究
探究SARS-CoV-2-HMGB1复合物是否通过内吞途径进入细胞。
使用内吞抑制剂dynasore和氯喹处理，检测病毒感染变化；通过PLA和免疫荧光观察内吞标志物共定位。
体内感染模型验证
在动物模型中验证HMGB1对SARS-CoV-2感染的增强作用。
BALB/c小鼠经鼻感染B.1.351变异株（与HMGB1预孵育），在24和48 hpi收集肺和气管，进行空斑实验和免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达纯化 | 镍离子亲和层析柱 | -- | -- |
| SPR分析 | Biacore T200 | Cytiva | -- |
| CM5传感器芯片 | Cytiva | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | GenDEPOT | R4100-010 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | GenDEPOT | P3100 | |
| 硝酸纤维素膜 | Cytiva | 10600001 | |
| 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-R001 | |
| 抗ACE2抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| 抗RAGE抗体 | Santa Cruz | sc-365154 | |
| 抗TMPRSS2抗体 | Santa Cruz | sc-515727 | |
| 抗6x His抗体 | Abcam | ab9108 | |
| 抗EEA1抗体 | CST | 3288S | |
| 抗GAPDH抗体 | Abfrontier | LF-PA0212 | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads蛋白G磁珠 | Invitrogen | 10004D |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| cDNA合成预混液 | Takara Bio | 639543 | |
| Power SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Welgene | LM0001-05 |
| RPMI-1640培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| HAM's/F-12K营养混合物 | Welgene | LM010-03 | |
| 胎牛血清 | Corning | 35-015-CV | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 52887 |
| 药物处理 | 可溶性RAGE | Sino Biological | 11629-HCCH |
| 阿齐瑞格 | Selleckchem | S6415 | |
| dynasore | Sigma-Aldrich | D7693 | |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| 人ACE2蛋白 | Sigma-Aldrich | SAE0064 | |
| 伪病毒实验 | Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | N1110 |
| PLA | Duolink原位荧光检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| IHC | FLEX靶向修复液 | Dako | k8005 |
| Envision Plus系统HRP标记聚合物 | DAKO | k4003/k4001 | |
| DAB显色液 | DAKO | k3468 | |
| 病毒复合物检测 | BS3交联剂 | Sigma-Aldrich | S5799 |
| Amicon Ultra离心过滤器 | Sigma-Aldrich | UFC5010 | |
| 流式细胞术 | 抗ACE2抗体 | R&D Systems | MAB9331 |
| BD FACS Verse II流式细胞仪 | BD | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | ZEISS | LSM780, 980 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HMGB1与刺突蛋白结合 | SPR分析中HMGB1各结构域的浓度范围和固定化刺突蛋白的密度；免疫共沉淀中孵育时间和温度。 阅读提示：Methods中Surface plasmon resonance和In vitro immunoprecipitation部分 |
| 体外感染实验 | A549和NCI-H1975细胞的接种密度；病毒MOI（1）；HMGB1浓度（2和20 μg/mL）；预孵育时间（1小时）；感染时间和后续培养时间（3小时）。 阅读提示：Methods中Virus infection部分 |
| RAGE依赖性验证 | sRAGE浓度（40 μg/mL）和预处理时间（2小时）；azeliragon剂量范围；shRNA-ACE2敲低效率。 阅读提示：Methods中Virus infection部分和结果图3 |
| 内吞机制研究 | dynasore和氯喹的浓度（30 μM）和预处理时间（2小时）；PLA实验的抗体浓度和孵育时间。 阅读提示：Methods中Proximity ligation assay部分和结果图4 |
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄和性别（7周龄雌性BALB/c）；病毒株（B.1.351）和滴度（2×10^5 PFU）；HMGB1剂量（2和20 μg/mL）；接种体积（50 μL）；处死时间（24和48 hpi）。 阅读提示：Methods中Animal model和Virus infection部分 |