检测Gal-3在糖尿病皮肤中的表达
明确Gal-3在糖尿病皮肤中的表达变化，以及是否与血管生成相关
分析人类皮肤蛋白质组数据，并在糖尿病患者和STZ大鼠皮肤组织中进行免疫组化染色，检测Gal-3、Gal-1和Gal-7的表达，并评估CD31阳性血管区域的Gal-3水平。
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晚期糖基化终末产物破坏Galectin-3与整合素α5β1的相分离抑制糖尿病创面愈合
Galectin-3-integrin α5β1 phase separation disrupted by advanced glycation end-products impairs diabetic wound healing in rodents.
实验完整度
高包含体内动物模型（STZ大鼠、HFD/STZ小鼠、db/db小鼠）与体外细胞实验（HMEC-1、HUVECs）等多层级验证，并进行分子机制（LLPS、FAK信号）及功能回复验证。
主要模型
STZ诱导的糖尿病大鼠模型 HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型 STZ诱导的db/db小鼠模型 HMEC-1和HUVECs内皮细胞
重点核对
局部过表达Gal-3的腺病毒注射剂量：大鼠5.0×10^9 PFU/只，小鼠2.0×10^9 PFU/只 STZ大鼠造模剂量：65 mg/kg；HFD/STZ小鼠造模剂量：100 mg/kg；db/db小鼠剂量：40 mg/kg Gal-3抑制剂GB1107浓度：雌性小鼠133 μM，雄性小鼠100 μM，100 μL/只，隔天一次 整合素β1抗体剂量：100 μg/只（大鼠） FAK抑制剂PF573228浓度：15 μM，100 μL/只，隔天一次（小鼠）
摘要
糖尿病足溃疡是严重的糖尿病并发症，促进受损的血管生成对于创面愈合至关重要。促血管生成的galectin-3在糖尿病血清中升高，并可促进系统性胰岛素抵抗，这可能会损害创面愈合。然而，galectin-3在糖尿病创面愈合调控中的确切作用仍不清楚。在此，我们证明galectin-3通过与其受体整合素α5β1结合，并与整合素α5β1形成液-液相分离，增强下游粘着斑激酶磷酸化，从而促进皮肤创面愈合和血管生成。在糖尿病条件下，异常积累的晚期糖基化终末产物与galectin-3结合，阻断其与整合素α5β1的相互作用，损害血管生成。在水凝胶中局部应用重组galectin-3可促进啮齿类动物糖尿病创面愈合，且不引起全身胰岛素抵抗，并与胰岛素具有协同作用。本研究阐明了galectin-3与整合素α5β1而非晚期糖基化终末产物的结合，通过形成相分离促进血管生成和糖尿病创面愈合，为局部galectin-3治疗糖尿病足溃疡奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Galectin-3在糖尿病创面愈合中的作用及机制尚不清楚，本研究旨在阐明Gal-3是否通过作用于血管生成影响糖尿病创面愈合。
- 核心机制
- Gal-3通过其碳水化合物识别域与整合素α5β1的N-聚糖结合，形成液-液相分离，促进整合素β1磷酸化及下游FAK磷酸化，从而促进血管生成；糖尿病的AGEs与Gal-3结合，竞争性抑制Gal-3与整合素α5β1的相互作用，破坏相分离和FAK信号。
- 主要证据
- 体外实验显示重组Gal-3促进HMEC-1细胞迁移和管形成，且该作用可被整合素α5β1阻断抗体或抑制剂抑制；体内实验显示局部过表达Gal-3促进糖尿病大鼠和小鼠创面闭合、胶原沉积和血管密度，FAK抑制剂可逆转Gal-3促进愈合的作用。
- 研究意义
- 本研究为糖尿病足溃疡提供了一种潜在的治疗策略，即局部应用Gal-3负载水凝胶，且与胰岛素联用可增强疗效，为临床治疗糖尿病足溃疡奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Gal-3对糖尿病创面愈合的作用
确定局部过表达Gal-3是否能促进糖尿病创面愈合
在STZ大鼠和HFD/STZ小鼠背部制作全层皮肤伤口，创缘局部注射表达Gal-3的腺病毒，观察创面闭合率、胶原沉积和血管密度。
检测Gal-3抑制或敲除的影响
验证内源性Gal-3对创面愈合的必要性
在正常小鼠或糖尿病大鼠中应用Gal-3抑制剂GB1107或敲低整合素α5，观察创面愈合指标。
鉴定Gal-3的功能受体
确定Gal-3促进血管生成所依赖的细胞表面受体
通过免疫沉淀-质谱、GST pull-down、功能阻断抗体和基因敲低等方法，鉴定Gal-3结合蛋白并验证其功能。
验证Gal-3与整合素α5β1形成相分离
明确Gal-3与整合素α5β1是否形成液-液相分离并介导信号传导
体外将GFP-Gal-3与整合素β1或α5β1混合观察液滴形成；在CHO-K1细胞中表达mCherry-integrin α5，加入GFP-Gal-3观察共定位和形成凝聚体；进行FRAP实验和1,6-HD处理，并检测FAK磷酸化。
评估AGEs对Gal-3与整合素α5β1相互作用的抑制
探究糖尿病状态下AGEs如何抑制Gal-3介导的血管生成
检测AGEs对Gal-3诱导的管形成、整合素β1磷酸化及Gal-3与整合素β1结合的影响；通过HSQC NMR和BLI分析结合亲和力；在细胞和体外验证AGEs抑制相分离凝聚体的形成。
AGEs抑制剂的体内效应
验证降低AGEs能否恢复糖尿病创面愈合中Gal-3介导的血管生成
将AGEs抑制剂吡哆胺负载于水凝胶应用于STZ大鼠创面，检测创面闭合率和血管密度，以及AGEs水平和p-integrin β1水平。
Gal-3水凝胶的治疗效果评价
评估局部应用Gal-3水凝胶促进糖尿病创面愈合的治疗潜力，并与胰岛素联用
将重组Gal-3负载于温敏水凝胶（Pluronic F-127/甲基纤维素），在STZ大鼠和db/db小鼠创面局部应用，评估创面闭合、胶原沉积、血管生成等，并与VEGF水凝胶和Comfeel®敷料比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 糖尿病动物模型建立 | 链脲佐菌素 | Sigma | 18883-66-4 |
| 动物处理（Gal-3抑制剂） | GB1107 | MCE | HY-114409 |
| 动物处理（FAK抑制剂） | PF573228 | Selleck | S2013 |
| 水凝胶制备 | 泊洛沙姆407 | Sigma | P2443 |
| 甲基纤维素 | Sigma | M7027 | |
| 水凝胶制备（对照） | 血管内皮生长因子 | Sino Biological | 11066-HNAH |
| 水凝胶应用（阳性对照敷料） | 康维德® | Coloplast | 3533 |
| 细胞培养 | MCDB 131培养基 | Gibco | 10372019 |
| F-12K培养基 | Hyclone | SH30526.01 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 细胞培养（原代肝细胞） | DMEM/F12培养基 | Gibco | 11320033 |
| 细胞培养（添加因子） | 重组人表皮生长因子 | 上海派真生物 | 105-04 |
| 氢化可的松 | MCE | HY-N0583 | |
| 细胞培养（抗生素） | 青霉素-链霉素 | -- | -- |
| 基因操作（敲低） | 脂质体转染试剂RNAiMAX | Thermo Scientific | -- |
| 基因操作（过表达） | 嘌呤霉素 | Invivogen | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | EpiZyme | PC102 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | CWBIO | CW2200 | |
| 磷酸酶抑制剂 | CWBIO | CW2383 | |
| PVDF膜 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖4B珠子 | Millipore | G4510 |
| DTSSP交联剂 | Thermo Scientific | 21578 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素 | Thermo Scientific | 21331 | |
| NeutrAvidin琼脂糖珠子 | Thermo Scientific | 29200 | |
| ELISA | 人Gal-3 ELISA试剂盒 | Boster | EK0764 |
| 人VEGF ELISA试剂盒 | Boster | EK0539 | |
| 大鼠Gal-3 ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-EL012887RA | |
| 生化指标检测 | ALT检测试剂盒 | 南京建成 | C009-2-1 |
| AST检测试剂盒 | 南京建成 | C010-2-1 | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | 南京建成 | A111-1-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | 南京建成 | A110-1-1 | |
| 尿素氮检测试剂盒 | 南京建成 | C013-2-1 | |
| 流式分析 | 细胞周期分析试剂盒 | Beyotime | C1062S |
| 细胞毒性检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0037 |
| 免疫印迹（抗体） | CD31抗体（ab281583） | Abcam | ab281583 |
| 整合素β1抗体（610467） | BD Biosciences | 610467 | |
| 磷酸化整合素β1 (Y783)抗体（ab62337） | Abcam | ab62337 | |
| FAK抗体（12636-1-AP） | Proteintech | 12636-1-AP | |
| 磷酸化FAK (Y397)抗体（611806） | BD Biosciences | 611806 | |
| AKT抗体（9272S） | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 磷酸化AKT (Ser473)抗体（9271S） | Cell Signaling Technology | 9271S | |
| Gal-3抗体（ab76245） | Abcam | ab76245 | |
| 免疫组织化学（抗体） | Gal-1抗体（11858-1-AP） | Proteintech | 11858-1-AP |
| Gal-7抗体（16730-1-AP） | Proteintech | 16730-1-AP | |
| AGE抗体（BS-1158R） | Bioss | BS-1158R | |
| 整合素α5抗体（ab150361） | Abcam | ab150361 | |
| 细胞迁移（功能阻断） | 整合素α5功能阻断抗体（MAB1956Z） | Chemicon | MAB1956Z |
| 整合素β1功能阻断抗体（CBL481） | Chemicon | CBL481 | |
| 细胞迁移（整合素α5β1拮抗剂） | ATN-161 | -- | -- |
| 细胞迁移（EGFR抑制剂） | ZD1839 | Selleck | S1025 |
| 细胞迁移（VEGFR抑制剂） | PTK787 | Selleck | S1101 |
| 蛋白纯化（糖苷酶） | 肽N-糖苷酶F | New England BioLabs | P0704S |
| 相分离实验（试剂） | 乳糖 | -- | -- |
| 1,6-己二醇 | Aladdin | H103708 | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus | Takara | 9108Q |
| Evo M-MLV反转录试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11728 | |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11701 | |
| 图像分析 | Fiji/ImageJ | -- | -- |
| 统计软件 | GraphPad Prism 9.0 | -- | -- |
| 流式细胞仪 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 共聚焦显微镜 | LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 荧光显微镜 | BX63显微镜 | Olympus | -- |
| 电子显微镜 | Regulus 8100扫描电镜 | Hitachi | -- |
| 分光光度计 | Nanodrop 2000微量分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| 粒径分析仪 | Nano-ZS ZEN3600粒径分析仪 | Malvern Instruments | -- |
| 微流成像 | ECLIPSE Ti2-E倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 超分辨显微镜 | A1R N-SIM N-STORM超分辨显微镜 | Nikon | -- |
| 核磁共振波谱仪 | Bruker 850 MHz核磁共振波谱仪 | Bruker | -- |
| 生物膜干涉 | ForteBio Octet RED 96生物膜干涉仪 | ForteBio | -- |
| microCT | SkyScan 1276 microCT | Bruker | -- |
| 激光多普勒血流仪 | 激光多普勒血流仪 | ADInstruments | INC191 |
| 质谱 | AB SCIEX 5500质谱仪 | SCIEX | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 糖尿病动物模型建立 | STZ剂量、给药途径（腹腔注射）、溶剂（柠檬酸缓冲液pH 4.2）、动物品系、性别、年龄、造模成功标准 阅读提示：Methods: Diabetic wound models |
| Gal-3过表达 | 腺病毒载体、注射剂量（PFU/只）、注射方式（皮内）、注射时间点 阅读提示：Methods: Treatments of animals |
| Gal-3抑制 | GB1107浓度（雌雄不同）、注射体积、给药频率 阅读提示：Methods: Treatments of animals |
| 整合素α5敲低 | AAV血清型、启动子、注射剂量（vg/cm²）、注射时间 阅读提示：Methods: Treatments of animals |
| FAK抑制 | PF573228浓度、溶剂（0.1% DMSO）、注射剂量和频率 阅读提示：Methods: Treatments of animals |
| 创面制作与测量 | 创面直径（大鼠20mm，小鼠8mm）、麻醉方法、创面面积测量方法、创面闭合率计算公式 阅读提示：Methods: Measurement of skin wound healing |
| 水凝胶制备与应用 | Pluronic F-127浓度（15%）、甲基纤维素浓度（2%）、Gal-3浓度（100 μg/mL）、VEGF浓度（150 ng/mL）、AGEs抑制剂浓度（100 mg/mL）、制备温度、储存温度 阅读提示：Methods: Treatments of animals (hydrogel preparation) |
| 体外细胞实验 | 细胞系（HMEC-1、HUVEC、CHO-K1）、培养条件（培养基、血清浓度）、血清饥饿时间、Gal-3处理浓度和时间、抑制剂浓度 阅读提示：Methods: Cell culture, Cell migration assay, In vitro angiogenesis assay |
| 蛋白相互作用验证 | GST-Gal-3浓度、细胞裂解液用量、pull-down时间、洗脱液组成、抗体 阅读提示：Methods: Pull-down assay |