抗体发现与筛选
从合成噬菌体展示文库中筛选与hPD-1结合并阻断hPD-1/PD-L1相互作用的scFv克隆。
通过三轮溶液淘选，使用生物素化的hPD-1蛋白（浓度递减）筛选，共筛选315个克隆，其中215个结合hPD-1，60个具有独特序列，39个能阻断hPD-1/PD-L1相互作用。
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发现并表征两种具有独特结合机制的抗人PD-1抗体
Discovery and characterization of two anti-PD-1 antibodies with a unique binding mechanism to human PD-1.
实验完整度
高包含多层级实验：体外生化（SPR、ELISA）、细胞功能（Jurkat报告基因）、体内药效（转基因小鼠模型）及结构表征（XL-MS）
主要模型
C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)/Bcgen小鼠（B-hPD-1转基因小鼠） MC38-hPD-L1结肠癌细胞系 过表达hPD-1的Jurkat报告细胞系 CHO-K1细胞系（用于表达hPD-L1）
重点核对
抗体结合hPD-1的KD值（UDIZ-007为3.5 nM，UDIZ-008为2.8 nM） 体内实验剂量和给药方案（10 mg/kg，腹腔注射，第0,3,7,10,14,17天） 肿瘤模型（MC38-hPD-L1细胞皮下接种1x10^6） 实验终点（肿瘤生长监测至第56天，肿瘤消失时间约第17天）
摘要
靶向检查点抑制剂是治疗癌症的有效疗法，其中人程序性细胞死亡蛋白1（hPD-1）是开发抗体药物最成功的靶点之一。在这项工作中，我们从全合成人噬菌体展示库中分离了一系列具有不同结合和功能特征的反PD-1单链可变片段。将最佳克隆转化为hIgG1LALA和hIgG4PE格式，分别称为UDIZ-007和UDIZ-008，所得的抗体有效阻断PD-1:PD-L1/L2相互作用，并且高度选择性，不与CD28受体家族成员发生交叉反应。在B-hPD-1转基因小鼠中，以10 mg/kg的剂量每3天一次，共6次腹腔注射UDIZ-007或UDIZ-008，在第17天根除了MC38-hPD-L1结肠肿瘤，直至研究结束第56天无复发。重要的是，与已知结构的抗PD-1抗体相比，这些抗体在独特区域结合hPD-1，这可能对新型肿瘤适应症作为单一疗法或与当前批准的抗PD-1治疗性抗体联合使用产生影响。因此，UDIZ-007和UDIZ-008似乎是开发靶向检查点抑制剂的抗体药物治疗癌症的有希望的候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在发现具有独特结合机制的新型抗PD-1抗体，并评估其作为癌症免疫治疗药物的潜力。
- 核心机制
- UDIZ-007和UDIZ-008通过结合hPD-1的C'D环和β链D/E区域（不直接重叠PD-L1结合位点）发挥阻断作用，可能通过空间位阻或诱导构象变化来阻止PD-1与PD-L1/L2的相互作用。
- 主要证据
- 通过SPR、ELISA和细胞实验证明抗体阻断hPD-1/PD-L1/L2相互作用；在B-hPD-1转基因小鼠的MC38-hPD-L1结肠癌模型中，UDIZ-007和UDIZ-008在10 mg/kg剂量下导致肿瘤完全消退（第17天），且无复发。
- 研究意义
- UDIZ-007/008的独特表位可能使其在单独使用或与现有抗PD-1抗体联合使用时，对新型肿瘤适应症产生疗效，为癌症治疗提供新的选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选抗体转化为IgG并表达
将最佳scFv克隆转化为全人IgG抗体，并表达纯化以获得用于功能研究的抗体。
将选定的scFv（如D6E）的VH和VL区域克隆到含有hIgG1LALA或hIgG4PE恒定区的载体中，在CHO细胞中共转染表达，通过蛋白A亲和层析纯化。
理化表征
评估抗体的物理化学性质，包括纯度、分子量和热稳定性，以确保其适合进一步开发。
使用SDS-PAGE、SEC-UPLC、完整质量MS和热稳定性分析（Protein Thermal Shift™）对UDIZ-007和UDIZ-008进行表征。
体外功能验证
验证抗体的结合特异性、亲和力和阻断PD-1/PD-L1/L2相互作用的能力。
通过SPR测定亲和力，ELISA和流式细胞术检测与hPD-1及CD28家族成员的特异性；利用Jurkat报告细胞和CHO-K1细胞评估功能性阻断。
体内药效评价
评估UDIZ-007和UDIZ-008在hPD-1转基因小鼠结肠癌模型中的抗肿瘤效果。
在C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)/Bcgen小鼠皮下接种MC38-hPD-L1肿瘤细胞，肿瘤体积75-125 mm^3时分组（每组6只），腹腔注射10 mg/kg抗体（第0,3,7,10,14,17天），监测肿瘤生长至第56天。
表位定位
确定UDIZ-007在hPD-1上的结合表位，以阐明其独特的结合机制。
使用化学交联质谱（XL-MS）鉴定UDIZ-007与hPD-1复合物的交联位点，映射到hPD-1的残基80-115区域。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体发现 | Acro Biosystems生物素化hPD-1蛋白 | Acro Biosystems | PD1-H82E4 |
| 筛选 | Nunc深孔板 | Thermo Fisher Scientific | 278743 |
| scFv表达 | 蛋白L | ProSpec | pro 1790-b |
| 蛋白A-辣根过氧化物酶 | Invitrogen | 101023 | |
| TMB底物 | BD Biosciences | 555214 | |
| 终止液 | Abcam | ab171529 | |
| SpectraMax M3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 结合和阻断 | iQue3流式细胞仪 | Sartorius | -- |
| 链霉亲和素包被的QBeads | Sartorius | -- | |
| 蛋白L-PE | Sino Biological | 11044-H07E-P | |
| 阻断 | 生物素化hPD-L1 | Acro Biosystems | PD-1-H82E5 |
| 生物素化hPD-L2 | Acro Biosystems | PD2-H82E8 | |
| 链霉亲和素-PE | BD Biosciences | 554061 | |
| 抗体表达 | TGEX哺乳动物表达载体 | Antibody Design Labs | -- |
| 抗体纯化 | HiTrap蛋白A HP | Cytiva | 17-0403-01 |
| SDS-PAGE | Mini-PROTEAN TGX免染蛋白凝胶 | Bio-Rad | 4568125 |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| SEC-UPLC | Acquity UPLC BEH 200 SEC色谱柱 | Waters | 186005225 |
| 完整质量 | Vion Q-TOF质谱仪 | Waters | -- |
| Acquity UPLC BEH C4色谱柱 | Waters | -- | |
| 热稳定性 | SYPRO橙色染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 7500快速实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SPR | Biacore T200 | Cytiva | -- |
| CM5芯片 | Cytiva | BR100399 | |
| 胺偶联试剂盒 | Cytiva | -- | |
| HBS-EP缓冲液 | Cytiva | -- | |
| 抗人Fc多克隆抗体 | R&D Systems | G-102-C | |
| hPD-1蛋白 | Acro Biosystems | PD1-H522a | |
| cPD-1蛋白 | Acro Biosystems | PD1-C52H5 | |
| His标签FcγRI | R&D Systems | 1257-FC | |
| His标签FcγRIIa | R&D Systems | 1330-CD | |
| His标签FcγRIIIa（V158） | R&D Systems | 4325-FC | |
| FcγRIIIa V158F多态性变体 | Acro Biosystems | CD8-H52H4 | |
| ELISA | 重组人CD28 | Sino Biological | 11524-HCCH |
| 重组人CTLA-4 | Sino Biological | 11159-HNAH | |
| 重组人ICOS | Sino Biological | 11559-H08H | |
| 山羊抗人IgG Fc-HRP | Abcam | ab97225 | |
| 细胞结合 | PD-1/NFAT报告基因Jurkat重组细胞 | BPS Bioscience | 60535 |
| 山羊抗人IgG Fc二级抗体（PE偶联） | Invitrogen | 12-4998-82 | |
| 细胞阻断 | PD-L1/TCR激活因子CHO重组细胞系 | BPS Bioscience | 60536 |
| Thaw Medium 3A培养基 | BPS Bioscience | 60186 | |
| 体内实验 | MC38-hPD-L1肿瘤细胞 | -- | -- |
| 可瑞达 | Merck | -- | |
| 欧狄沃 | Bristol-Myers Squibb | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体发现和筛选 | 噬菌体库构建，淘选浓度（100, 10, 1 nM），筛选实验（scFv表达、结合、阻断） 阅读提示：Materials and Methods: Antibody discovery, Screening for functional clones |
| 理化表征 | SDS-PAGE条件，SEC-UPLC条件，完整质量MS条件，热稳定性实验温度范围 阅读提示：Materials and Methods: Integrity by SDS-PAGE, Purity by SEC, Intact mass by MS, Thermal stability by Protein Thermal Shift™ |
| 体外功能 | SPR实验中的抗体浓度，分析物浓度，流速，接触时间；ELISA包被抗原浓度；细胞实验细胞数 阅读提示：Materials and Methods: KD by SPR, Binding to hPD-1 by ELISA, Binding to hPD-1 on Jurkat cells, Blocking by cell-based assay |
| 体内药效 | 动物品系，年龄，性别，细胞接种量，肿瘤体积范围，给药剂量，给药频率，观察时间 阅读提示：Materials and Methods: Efficacy in a hPD-1 transgenic mouse colon carcinoma model; Figure 9 legend |