鉴定FOXP1与ATR的相互作用
发现复制应激下调控ATR激活的新因子。
在HEK293T细胞中用ATR抗体免疫沉淀后进行质谱分析，鉴定到FOXP1，并通过内源免疫共沉淀验证了FOXP1与ATR和ATRIP的相互作用，且HU处理后相互作用增强。
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FOXP1磷酸化拮抗其O-GlcNAc糖基化在复制应激反应中调节ATR激活
FOXP1 phosphorylation antagonizes its O-GlcNAcylation in regulating ATR activation in response to replication stress.
实验完整度
高包含体外生化结合实验、细胞功能验证（siRNA敲低、DNA纤维实验）、机制研究（磷酸化、O-GlcNAc糖基化修饰）以及体内功能验证（突变体回补），证据层级多样。
主要模型
HEK293T细胞 H1975细胞 HEK293细胞
重点核对
FOXP1与ATR-ATRIP复合物的相互作用在HU处理下增强（图1B,C） FOXP1直接结合RPA包被的ssDNA，且AA465-555介导结合（图2A,B,C） CHK1介导FOXP1 S396磷酸化，抑制其O-GlcNAc糖基化（图4E,F,H） 致病突变体R465G/R514C/R465T/R514H增加O-GlcNAc糖基化、降低与ATR的相互作用（图5C,D）
摘要
ATR信号在感知和响应复制应激中至关重要；因此，任何缺陷都可能损害细胞功能和生存。ATR本身通过严格调控的机制被激活。在这里，我们鉴定出FOXP1，一个含有forkhead结构域的转录因子，作为协调ATR激活的调节因子。我们证明，不同于其作为转录因子的作用，FOXP1作为支架蛋白，直接结合RPA-ssDNA和ATR-ATRIP复合物，促进ATR的招募和激活。该过程受FOXP1的O-GlcNAc糖基化调节，抑制其与ATR的相互作用，而CHK1介导的FOXP1磷酸化在复制应激下抑制其O-GlcNAc糖基化。支持该环路的生理相关性，我们发现在各种肿瘤组织中发现的致病性FOXP1突变体具有受损的ATR激活和停滞复制叉稳定性。因此，我们得出结论，FOXP1可能作为相关肿瘤的潜在化疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FOXP1是否以及如何调节ATR在复制应激中的激活，以及其翻译后修饰（磷酸化和O-GlcNAc糖基化）在此过程中的作用。
- 核心机制
- FOXP1作为支架蛋白，直接结合RPA-ssDNA和ATR-ATRIP复合物，促进ATR招募到停滞复制叉并激活。FOXP1的O-GlcNAc糖基化抑制其与ATR的相互作用，复制应激下CHK1介导的FOXP1 S396磷酸化拮抗其O-GlcNAc糖基化，形成前馈环路促进ATR信号激活。
- 主要证据
- 通过免疫共沉淀和质谱鉴定FOXP1-ATR相互作用，体外实验证明FOXP1直接结合RPA和ssDNA，敲低FOXP1降低ATR染色质加载和CHK1磷酸化，破坏停滞复制叉稳定性，细胞活力降低；S396A突变降低FOXP1与ATR的相互作用，致病突变体损害ATR激活和叉稳定性。
- 研究意义
- FOXP1可能作为相关肿瘤的潜在化疗靶点，其缺陷可能部分解释FOXP1单倍剂量不足相关的发育障碍和肿瘤发生的病理机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FOXP1对ATR激活和复制叉稳定性的功能
探究FOXP1是否促进ATR激活并影响停滞复制叉稳定性。
用siRNA敲低FOXP1后，检测HU诱导的CHK1磷酸化；通过DNA纤维实验检测停滞复制叉的稳定性；通过克隆形成实验检测细胞对HU的敏感性。
研究FOXP1对ATR染色质加载的影响
检测FOXP1是否调控ATR在染色质上的加载。
通过染色质分级分离实验，检测FOXP1敲低后染色质部分中ATR的水平。
验证FOXP1与RPA-ssDNA的结合
确定FOXP1是否能直接结合RPA包被的ssDNA，并定位其结合区域。
使用生物素标记的ssDNA偶联磁珠，结合体外纯化的GST-FOXP1，检测FOXP1与ssDNA的结合；同时用His-RPA70/32预孵育ssDNA检测对FOXP1结合的影响；通过GST pull-down和免疫共沉淀检测FOXP1与RPA的直接相互作用。
验证FOXP1在停滞复制叉上的加载
在细胞内验证FOXP1是否定位于停滞复制叉。
使用EdU标记新生DNA，结合proximity ligation assay (PLA)和iPOND技术检测FOXP1在复制叉上的定位。
检测FOXP1的O-GlcNAc糖基化及其对ATR相互作用的影响
探究FOXP1的O-GlcNAc糖基化是否调节其与ATR的相互作用。
通过免疫共沉淀和体外糖基化实验验证OGT与FOXP1的相互作用及FOXP1的O-GlcNAc修饰。在OGT敲低或Thiamet-G处理后检测FOXP1与ATR的相互作用。
鉴定CHK1介导的FOXP1磷酸化及其功能
确定CHK1是否磷酸化FOXP1，并研究磷酸化对O-GlcNAc糖基化和ATR相互作用的影响。
通过体外激酶实验检测CHK1对FOXP1的磷酸化，并确定磷酸化位点S396。使用S396A和S396D突变体检测O-GlcNAc糖基化水平和与ATR的相互作用。
评估致病FOXP1突变体的功能缺陷
验证肿瘤和FOXP1综合征相关的FOXP1突变是否损害其在复制应激反应中的功能。
表达FOXP1突变体（R465G, R514C, R465T, R514H），检测其与ssDNA、RPA和ATR的相互作用，O-GlcNAc糖基化水平，ATR激活和S期阻滞，以及通过DNA纤维实验检测复制叉稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 改良Eagle培养基（DMEM） | HyClone | SH30243.01 |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FSP500 | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 线性聚乙烯亚胺（PEI） | Yeasen Biotechnology | 40816ES03 | |
| 药物处理 | 羟基脲 | Selleck | S1896 |
| Thiamet-G | Selleck | S7213 | |
| Rabusertib | Selleck | S2626 | |
| UCN-01 | Sigma-Aldrich | 539644 | |
| VE-822 | Selleck | S7102 | |
| NU6027 | Selleck | S7114 | |
| DNA纤维实验 | CldU | Sigma-Aldrich | C6891 |
| IdU | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 细胞周期分析 | BrdU | TargetMol | T6794 |
| 药物处理 | 喜树碱 | Sigma-Aldrich | S1288 |
| 体外磷酸化实验 | 对硝基苄基甲磺酸酯 | Abcam | ab138910 |
| ATP-γ-S | Abcam | ab138911 | |
| ATP钠盐 | Beyotime Biotechnology | ST1092 | |
| 重组人CHK1蛋白（GST标签） | SinoBiological | 10539-H09B | |
| 克隆构建 | 2×Phanta Flash Master Mix | Vazyme | P510 |
| pEASY®-Basic无缝克隆和组装试剂盒 | TransGen Biotech | CU201 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A Sepharose™ CL-4B | Cytiva Lifesciences | 17078001 |
| GST pull-down | 谷胱甘肽Sepharose™ 4B | Cytiva Lifesciences | 17075601 |
| His pull-down | HisSep Ni-NTA琼脂糖树脂6FF | Yeasen Biotechnology | 20503ES50 |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG亲和凝胶 | Selleck | B23102 |
| 转染 | Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| 蛋白质检测 | Super Signal West Femto底物试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Amersham Imager 600系统 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫荧光 | DragonFly共聚焦成像系统 | Andor | -- |
| 邻位连接 | Duolink原位检测试剂（红色） | Sigma-Aldrich | DUO92008 |
| Duolink原位PLA探针抗鼠PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92001 | |
| Duolink原位PLA探针抗兔MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92005 | |
| O-GlcNAc修饰分析 | UDP-GalNAz | Glycogene | SN-1016 |
| DBCO-mPEG5000 | Confluore | BCDG-9 | |
| iPOND | 链霉亲和素偶联磁珠M-280 | Invitrogen | -- |
| DNA结合实验 | 链霉亲和素磁珠M-280 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | HEK293T细胞（人） | ATCC | CRL-3216 |
| NCI-H1975细胞（人） | ATCC | CRL-5908 | |
| HEK293细胞（人） | ATCC | CRL-1573 | |
| 抗体 | 兔抗ATR多克隆抗体 | Bethyl Laboratories | A300-138A |
| 兔抗RPA32多克隆抗体 | Bethyl Laboratories | A300-244A | |
| 兔抗RPA70多克隆抗体 | Bethyl Laboratories | A300-241A | |
| 兔抗CHK1多克隆抗体 | Bethyl Laboratories | A300-298A | |
| 小鼠抗CHK1单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8408 | |
| 兔抗GINS1多克隆抗体 | Bethyl Laboratories | A304-170A | |
| 兔抗ATRIP多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2737 | |
| 兔抗ATRIP多克隆抗体 | ABclonal Technology | A5041 | |
| 兔抗FOXP1多克隆抗体 | ABclonal Technology | A12685 | |
| 兔抗FOXP1单克隆抗体 | PTM BIO | A5666 | |
| 兔抗pFOXP1 (S396)多克隆抗体 | This study (by PTM BIO) | -- | |
| 兔抗Actin单克隆抗体 | ABclonal Technology | AC026 | |
| 兔抗pCHK1(S345)单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2348 | |
| 兔抗pCHK1(S296)单克隆抗体 | Abcam | ab79758 | |
| 兔抗TopBP1单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14342 | |
| 小鼠抗O-GlcNAc单克隆抗体 (CTD110.6) | Cell Signaling Technology | 9875 | |
| 小鼠抗O-GlcNAc单克隆抗体 (RL2) | Abcam | ab2739 | |
| 小鼠抗GFP单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| 小鼠抗生物素单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53179 | |
| 小鼠抗FLAG单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 兔抗HA多克隆抗体 | Proteintech Group | 51064-2-AP | |
| 兔抗PCNA多克隆抗体 | Proteintech Group | 10205-2-AP | |
| 兔抗OGT多克隆抗体 | Proteintech Group | 11576-2-AP | |
| 兔抗ETAA1单克隆抗体 | Abcam | ab197017 | |
| 兔抗硫代磷酸酯单克隆抗体 | Abcam | ab92570 | |
| 兔抗H3多克隆抗体 | Abcam | ab18521 | |
| 小鼠抗GST单克隆抗体 | MBL Life Science | M209-3 | |
| 小鼠抗His单克隆抗体 | MBL Life Science | D291-3 | |
| 大鼠抗BrdU单克隆抗体 | Abcam | ab6326 | |
| 小鼠抗BrdU单克隆抗体 | BD Biosciences | 347580 | |
| Alexa Fluor™ 594标记驴抗小鼠IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21203 | |
| Alexa Fluor® 488标记驴抗大鼠IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-546-150 | |
| 过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-166 | |
| 过氧化物酶标记驴抗兔IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-035-152 | |
| 过氧化物酶标记小鼠抗兔IgG轻链单克隆抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 211-032-171 | |
| 过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG轻链二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-174 | |
| AffiniPure™山羊抗小鼠IgM µ链二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-005-020 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | HEK293T、H1975和HEK293细胞系来源（ATCC），培养基（DMEM），血清浓度（10%），转染试剂（PEI） 阅读提示：Methods section: Cell culture and transfection |
| 药物处理 | HU浓度（2 mM）和处理时间（1小时），Thiamet-G浓度（5 μM）和处理时间（24小时），CHK1抑制剂浓度（Rabusertib 5 μM，UCN-01 50 nM） 阅读提示：Methods section: Reagents and tools table; Figure legends (Fig 1B, 3B, 4B) |
| 免疫沉淀 | 细胞裂解缓冲液（NETN），抗体（特异性），孵育时间（4小时），洗涤条件（10分钟×3次） 阅读提示：Methods section: Immunoprecipitation, pull-down assay, and immunoblotting |
| DNA纤维实验 | CldU和IdU浓度（40 μM和100 μM），标记时间（0.5小时），HU处理浓度和时间（5 mM，4小时） 阅读提示：Methods section: DNA fiber assay; Figure legends (Fig 1E, 5F) |
| 体外DNA结合实验 | 生物素标记ssDNA序列，磁珠（Dynabeads M-280 Streptavidin），蛋白浓度 阅读提示：Methods section: In vitro DNA binding assay |
| 体外磷酸化实验 | 反应缓冲液（Tris-HCl pH 7.5, MgCl2, ATP-γ-S或ATP），孵育时间（30-60分钟），CHK1抑制剂UCN-01 阅读提示：Methods section: In vitro phosphorylation assay |
| 邻位连接实验（PLA） | EdU浓度（10 μM）和标记时间（15分钟），HU处理（2 mM，1小时），固定和透化条件 阅读提示：Methods section: Proximity ligation assay |
| iPOND | EdU浓度（10 μM）和标记时间（15分钟），HU处理（2 mM，1小时），甲醛固定，click反应条件，链霉亲和素磁珠 阅读提示：Methods section: iPOND |