An intranasal subunit vaccine induces protective systemic and mucosal antibody immunity against respiratory viruses in mouse models.
包含体外FcRn结合与转运实验、细胞中和实验、多种转基因小鼠模型（BALB/c、K18-hACE2、Tg32-hFc、HSA/hFcRn）的体内免疫原性和攻毒保护实验，以及肌肉注射mRNA疫苗和替代载体对照，明确了功能验证和机制验证。
BALB/c小鼠 K18-hACE2转基因小鼠 Tg32-hFc转基因小鼠 HSA/hFcRn转基因小鼠
RBD-MSA融合蛋白与ACE2和FcRn的结合能力 鼻内疫苗接种后血清和BALF中RBD特异性IgG和IgA抗体水平 血清和BALF抑制ACE2-RBD结合及假病毒中和效率 SARS-CoV-2攻毒后体重变化、肺病毒载量和组织病理学 对比肌肉注射mRNA疫苗和替代载体（转铁蛋白）对黏膜IgA的诱导效果
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证将抗原（RBD或HA）融合至白蛋白（MSA或HSA变体）后，其结构完整性、受体结合能力及FcRn结合特性是否保留。
构建RBD-MSA、RBD-QMP、RBD-WT、RBD-Tf、MSA-HA、AQ-HA、HA-QMP、HA-Tf等融合蛋白，并表达、纯化。通过ELISA检测其对ACE2、FcRn、转铁蛋白受体及表位特异性单克隆抗体的结合情况；通过表面等离子体共振（SPR）分析结合动力学；通过HERA和Transwell实验检测跨细胞转运和回收效率。
评估鼻内给予白蛋白融合疫苗在诱导全身和黏膜抗原特异性抗体（IgG、IgA）方面的能力，并比较不同载体和给药途径的效果。
在不同小鼠模型（BALB/c、Tg32-hFc等）中鼻内接种融合蛋白（加CpG佐剂），定期采血，收集BALF、鼻洗液、唾液等黏膜样本。通过FCBA和ELISA检测RBD-或HA特异性IgG和IgA抗体滴度及亚型；并通过流式细胞术检测纵隔淋巴结中抗原特异性B细胞比例。
评估疫苗诱导的抗体是否能抑制ACE2-RBD相互作用并中和SARS-CoV-2假病毒，以预测保护效果。
通过FCBA和ELISA检测血清和BALF抗体对ACE2-RBD结合的抑制百分比；使用表达GFP的SARS-CoV-2假病毒系统，在293T-hACE2-TMPRSS2细胞上检测血清和BALF的中和能力；部分实验使用HeLa-ACE2细胞和荧光素酶报告基因进行。
评估疫苗在活病毒攻击下的保护效果，包括生存率、体重变化、病毒载量和组织病理变化。
对接种疫苗的小鼠进行SARS-CoV-2（K18-hACE2）或流感A（PR8）活病毒攻毒，监测体重变化和生存率；攻毒后第7天处死，收集肺组织测定病毒载量（RT-qPCR）并做H&E染色病理分析。
比较白蛋白融合鼻内疫苗与肌肉注射mRNA疫苗及替代载体（转铁蛋白）对黏膜IgA诱导的差异。
在BALB/c和Tg32-hFc小鼠中，设置RBD-MSA或RBD-QMP鼻内接种、BioNTech-Pfizer mRNA疫苗肌肉注射、RBD-Tf鼻内接种等组，在终点收集血清和黏膜样本，检测RBD特异性IgG和IgA，并评估ACE2-RBD抑制和中和活性。
探究将佐剂CpG直接偶联至白蛋白融合蛋白（CpG-RBD-QMP）对免疫应答的影响，以及是否产生针对白蛋白的抗体。
通过马来酰亚胺化学将CpG偶联至RBD-QMP的Cys34，纯化后表征其结合活性。在Tg32-hFc和HSA/hFcRn小鼠中鼻内接种CpG-RBD-QMP或RBD-QMP加游离CpG，检测RBD特异性抗体和B细胞反应，并检测HSA特异性抗体。
评估疫苗诱导的抗体对SARS-CoV-2多种变异株的交叉反应性和中和能力。
用FCBA和ELISA检测血清和黏膜样本中抗体对Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron等变异株RBD的结合活性；用假病毒中和实验检测对携带不同Spike变异株的假病毒的中和能力。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | Expi293F细胞 | Gibco | A14527 |
| HEK293E细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668500 | |
| 蛋白纯化 | HisTrap HP层析柱 | Cytiva | 17524801 |
| 人白蛋白亲和基质 | Thermo Fisher Scientific | 1912970 | |
| AlbuPure白蛋白亲和吸附剂 | Astrea | 3151 | |
| Amicon Ultra离心过滤器 | Merck Millipore | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶柱 | Cytiva | 28-9909-44 | |
| Bolt 12% Bis-Tris Plus凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NW00125 | |
| 蛋白分析 | DS-11+分光光度计 | DeNovix | -- |
| 佐剂偶联 | CpG寡脱氧核苷酸1826 | Integrated DNA Technologies | -- |
| SM(PEG)8连接剂 | Sigma-Aldrich | 746207 | |
| 细胞实验 | HMEC-1-hFcRn细胞 | Lencer lab | -- |
| MDCKII-hFcRn细胞 | Roche | -- | |
| 293T-hACE2-TMPRSS2细胞 | -- | -- | |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Janvier-Labs | -- |
| K18-hACE2小鼠 | The Jackson Laboratory | 034860 | |
| Tg32-hFc小鼠 | The Jackson Laboratory | 029686 | |
| HSA/hFcRn小鼠 | genOway | -- | |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 攻毒实验 | 甲型流感病毒H1N1（A/PR/8/34） | ATCC | VR-95 |
| SARS-CoV-2 WA1/2020病毒 | -- | -- | |
| 病毒RNA定量 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| UltraPlex一步法ToughMix | Quantabio | 95166 | |
| ELISA | TMB显色液 | Calbiochem | CL07 |
| 受体结合实验 | 重组人ACE2 | Sino Biological | 10108-H08H |
| 重组小鼠转铁蛋白受体 | Sino Biological | 50741-M07H | |
| 免疫原性检测 | R-藻红蛋白偶联的抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | 31861 |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FACSymphony A5流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 中和实验 | BrightGlo荧光素酶底物 | Promega | E2620 |
| BioTek Synergy 2酶标仪 | Agilent | -- | |
| Western blot | Bolt 4-12% Bis-Tris Plus凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NW04125 |
| iBlot 2 PVDF Mini转印叠 | Thermo Fisher Scientific | IB24002 | |
| 山羊抗小鼠IgA-HRP | Bethyl | A90-103P | |
| SuperSignal West Pico PLUS底物 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| SPR | Biacore T200表面等离子体共振仪 | Cytiva | -- |
| CM5传感器芯片 | Cytiva | 29149603 | |
| 中和实验 | Incucyte S3活细胞成像系统 | Sartorius | 4647 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白融合表达 | 表达系统（Expi293F或HEK293E）、载体（pFUSE2ss-CLIg-hk或pcDNA3）、转染试剂、纯化方法（亲和层析、SEC） 阅读提示：Methods: Vector design and production of RBD and RBD fusion proteins |
| 鼻内接种 | 小鼠品系、年龄、性别；疫苗剂量（RBD-MSA 19.9 μg、RBD-QMP 20.0 μg等）；佐剂CpG用量；接种体积（20 μL，10 μL/鼻孔）；初免加强时间 阅读提示：Methods: In vivo vaccine studies |
| 抗体检测 | 样本类型（血清、BALF、鼻洗液、唾液）、稀释度、检测方法（FCBA、ELISA） 阅读提示：Methods: Quantification of RBD-specific antibodies in FCBA |
| 中和实验 | 假病毒构建方法、细胞系（293T-hACE2-TMPRSS2）、血清和BALF的稀释度、感染检测方法 阅读提示：Methods: Spike pseudotyped neutralization with mouse sera or BALF |
| 攻毒实验 | 病毒株（SARS-CoV-2 WA1/2020剂量2×10^4 pfu，流感PR8为5×LD50）、攻毒时间、监测指标、终点标准 阅读提示：Methods: Live virus challenge |
