体外抗肿瘤活性评估
评估SB-T-101141对乳腺癌细胞增殖、克隆形成和细胞死亡的影响，并与紫杉醇比较。
使用CCK-8、EdU标记、克隆形成、PI染色等方法检测不同浓度SB-T-101141处理后MCF-7、MDA-MB-453等细胞的活性、增殖和死亡情况。
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新型紫杉烷SB-T-101141通过铁稳态相关KHSRP触发非经典铁死亡以克服乳腺癌的紫杉醇耐药
A novel taxane SB-T-101141 triggers a noncanonical ferroptosis to overcome Paclitaxel resistance of breast cancer via iron homeostasis-related KHSRP.
实验完整度
高包含体外细胞功能验证、铁死亡表型分析、CRISPR筛选靶点鉴定、体内移植瘤模型及类器官等多层级验证。
主要模型
MCF-7乳腺癌细胞系 MDA-MB-453乳腺癌细胞系 MCF-7PR紫杉醇耐药乳腺癌细胞系 MCF-7异种移植瘤小鼠模型
重点核对
SB-T-101141处理浓度及时间：MCF-7为3μM处理24h，MCF-7PR为1.5μM处理24h DFOM预处理浓度及时间：50μM预处理1h KHSRP敲低稳定细胞系构建：使用shRNA靶向KHSRP 异种移植瘤模型：BALB/c裸鼠，MCF-7细胞接种量为5×10^6
摘要
获得性多药耐药阻碍了紫杉醇的临床应用。在此，我们揭示了紫杉烷SB-T-101141能有效诱导紫杉醇耐药和亲本乳腺癌细胞发生一种新型的铁死亡样细胞死亡。功能上，SB-T-101141促进了铁和亚铁离子以及活性氧（ROS）的产生，包括脂质ROS和脂质过氧化衍生的醛类，如丙二醛（MDA），并导致谷胱甘肽（GSH）耗竭。铁螯合剂和ROS清除剂显著减弱了细胞死亡以及SB-T-101141引起的无机ROS。然而，铁死亡相关的脂质氧化物抑制剂不能阻断SB-T-101141引发的脂质ROS和细胞死亡。同时，通过全基因组CRISPR-Cas9筛选，我们发现SB-T-101141与KH型剪接调节蛋白（KHSRP）结合，抑制与铁稳态相关的CDGSH铁硫结构域1（CISD1）的铁依赖性表达，从而导致了乳腺肿瘤的一种新型铁死亡。此外，RNA深度测序表明，SB-T-101141通过KHSRP协同增强了铁依赖性的JNK和PERK通路激活。总之，我们的研究结果证明了SB-T-101141作为新型铁死亡诱导剂在紫杉醇耐药乳腺癌治疗中的潜在临床应用价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新型紫杉烷SB-T-101141能否以及如何克服乳腺癌的紫杉醇耐药？
- 核心机制
- SB-T-101141直接结合KHSRP蛋白的P572位点，抑制铁稳态相关蛋白CISD1的表达，触发了非经典铁死亡，并通过铁依赖性方式激活JNK和PERK信号通路。
- 主要证据
- CRISPR-Cas9筛选鉴定KHSRP为靶点，CETSA和分子对接验证了结合，KHSRP敲低和DFOM处理逆转了SB-T-101141诱导的铁积累、脂质ROS升高、CISD1下调及细胞死亡，体内异种移植瘤实验证实了其抗肿瘤效果。
- 研究意义
- SB-T-101141作为一种新型铁死亡诱导剂，在紫杉醇耐药乳腺癌治疗中具有潜在临床应用价值，并为铁死亡相关研究提供了有价值的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞死亡机制初步鉴定
确定SB-T-101141诱导的细胞死亡类型是否与凋亡或坏死相关。
利用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死抑制剂Necrostatin-1处理，结合形态学观察、LDH释放、线粒体膜电位和ATP水平检测，排除凋亡和坏死。
铁死亡特征验证
验证SB-T-101141诱导的细胞死亡是否具有铁死亡的特征。
通过透射电镜观察线粒体形态，检测铁、亚铁离子、脂质ROS、MDA、GSH水平，并使用铁螯合剂（DFOM）、ROS清除剂（NAC）及铁死亡抑制剂（Fer-1、Lip-1）进行干预。
靶点鉴定
鉴定SB-T-101141的分子靶点。
通过全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，结合细胞活力、克隆形成、细胞死亡和脂质ROS检测，确定KHSRP为关键靶点，并通过CETSA和分子对接验证结合。
机制验证
验证SB-T-101141通过KHSRP调控CISD1表达及下游信号通路的机制。
在KHSRP敲低的细胞中，检测SB-T-101141处理后CISD1的表达水平、铁积累、脂质ROS水平，以及JNK和PERK通路的磷酸化水平。
体内药效评估
评估SB-T-101141在体内对紫杉醇耐药乳腺癌的抑瘤效果。
建立MCF-7和MCF-7PR异种移植瘤模型，给予SB-T-101141治疗，监测肿瘤体积和重量，并通过IHC分析肿瘤组织中相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 药物处理 | 紫杉醇 | Selleck | S1150 |
| SB-T-101141 | -- | -- | |
| 细胞凋亡抑制 | Z-VAD-FMK | Selleck | S7023 |
| 铁死亡抑制 | Liproxstatin-1 | Selleck | S7699 |
| 铁死亡诱导 | RSL3 | Selleck | S8155 |
| 通路抑制 | GSK2606414 | MCE | HY-18072 |
| SP600125 | MCE | HY-12041 | |
| SB202190 | MCE | HY-10295 | |
| 铁螯合 | 甲磺酸去铁胺 | MCE | HY-B0988 |
| 环吡酮 | MCE | HY-B0450 | |
| 铁死亡抑制 | Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 |
| ROS清除 | N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 |
| 染色 | 可溶性普鲁士蓝 | Sigma-Aldrich | 03899 |
| 溶剂 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 |
| Kolliphor® EL | Sigma-Aldrich | C5135 | |
| 染色 | 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T0776 |
| 结晶紫 | Amresco | 0528 | |
| 细胞活性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | CK04 |
| 细胞毒性检测 | CytoTox 96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| 脂质ROS检测 | BODIPY 581/591 C11 | Invitrogen | D3861 |
| 线粒体检测 | MitoTracker Green | Bestbio | BB-41293-1 |
| ROS检测 | DCFH-DA | Bestbio | BB-47053-1 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-10 | Bestbio | BB-41052-2 |
| Western blot | 抗β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 |
| 抗eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 5324 | |
| 抗磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 3398 | |
| 磷酸化MAPK家族抗体套装 | Cell Signaling Technology | 9910 | |
| MAPK家族抗体套装 | Cell Signaling Technology | 9926 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 抗Caspase-7抗体 | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| 抗Cyclin B1抗体 | Cell Signaling Technology | 12231 | |
| 抗Cdc25c抗体 | Cell Signaling Technology | 4688 | |
| 抗Cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 55506 | |
| 抗Cyclin D3抗体 | Cell Signaling Technology | 2936 | |
| 抗CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 | |
| 抗CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | 13331 | |
| 抗CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2546 | |
| 抗P21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗P27抗体 | Cell Signaling Technology | 3686 | |
| 抗小鼠IgG，HRP标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗兔IgG，HRP标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗KHSRP抗体 | Abcam | ab150393 | |
| 抗4-HNE抗体 | Abcam | ab48506 | |
| 免疫组织化学 | 抗PCNA抗体 | Abcam | ab29 |
| Western blot | 抗Actin抗体 | Sino Biological | 100166-MM10 |
| 抗CISD1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-517413 | |
| 抗G3BP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365338 | |
| 抗GPX4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166570 | |
| 抗Cdc2抗体 | BD Biosciences | 610037 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记驴抗小鼠IgG (H+L) | Life Technologies | A-21202 |
| Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG (H+L) | Life Technologies | A-21206 | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F9291 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A211-01 |
| Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A214-01 | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX S流式细胞仪 | BECKMAN COULTER | -- |
| 免疫荧光 | Mito-Tracker Red | Beyotime | C1049B |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | BestBio | BB-4104-3 |
| 细胞增殖检测 | Cell-Light EdU Apollo643体外试剂盒 | Ribobio | C10310-2 |
| 细胞内药物浓度检测 | TSQ Quantum Ultra质谱仪 | Thermo | -- |
| MDA检测 | 微量丙二醛检测试剂盒 | G-CLONE | SH113W-100 |
| 铁含量检测 | 细胞铁含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5315 |
| 亚铁离子检测 | 亚铁离子含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5415 |
| GSH检测 | 还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒 | Solarbio | BC1175 |
| ATP检测 | 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| 基因组DNA提取 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| PCR扩增 | 高保真2×PCR预混液 | NEB | M0541L |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 逆转录 | HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒（+gDNA去除） | Vazyme | R223-01 |
| qPCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q311-02 |
| CFX96 touch实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 磷酸酶抑制剂混合片剂 | Roche | 26920800 | |
| PMSF | GeneStar | B111-01 | |
| ECL化学发光液 | Millipore | WBKLS0500 | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| CETSA | Veriti 96孔热循环仪 | Applied Biosystems | 4375303 |
| 类器官培养 | 乳腺癌类器官试剂盒 | bioGenous | K2147-BC |
| 类器官活性检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7571 |
| Varioskan LUX多功能酶标仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD | 354262 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | MCF-7PR细胞系需在含10nM紫杉醇的DMEM培养基中维持，实验前需在无药培养基中培养至少一代 阅读提示：Materials and methods: Establishment of the Paclitaxel-resistant cell line MCF-7PR, Cell culture |
| 药物处理 | SB-T-101141的浓度和处理时间，例如MCF-7细胞3μM处理24h，MCF-7PR细胞1.5μM处理24h 阅读提示：Figure 2, Figure 3, Figure 5的图注 |
| 铁死亡抑制实验 | DFOM（50或100μM）、NAC（5或15mM）、Fer-1（30μM）、Lip-1（5μM）的预处理时间（1h） 阅读提示：Figure 3, Figure 5的图注 |
| 体内实验 | BALB/c裸鼠，细胞接种量（MCF-7: 5×10^6，MCF-7PR: 6×10^6），SB-T-101141给药剂量（5mg/kg，腹腔注射，每3天一次） 阅读提示：Materials and methods: Xenografted mouse assays |