RIPK1降解剂的开发与优化
设计并合成RIPK1 PROTAC分子，筛选高效降解RIPK1的先导化合物。
将RIPK1抑制剂与E3连接酶配体（VHL等）连接合成小分子库，通过Western blot检测Jurkat和B16F10细胞中RIPK1水平，优化连接链长度，确定先导化合物LD4172。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
开发一种RIPK1降解剂以增强抗肿瘤免疫
Development of a RIPK1 degrader to enhance antitumor immunity.
实验完整度
高体外降解筛选、机制验证（UPS依赖）、细胞凋亡检测、蛋白质组学、体内药效和免疫微环境分析等多层次验证。
主要模型
B16F10小鼠黑色素瘤细胞 MC38小鼠结肠癌细胞 Jurkat人T细胞白血病细胞 MDA-MB-231人乳腺癌细胞
重点核对
LD4172对RIPK1的降解浓度（DC50=4–400 nM）和降解动力学 LD4172在体内降解RIPK1的剂量和给药途径（20 mg/kg腹腔注射） 抗PD1抗体治疗剂量（100 μg/只）及给药频率（每3天一次） B16F10肿瘤接种细胞数（3×10^5）及肿瘤模型建立时间 联合治疗中CD8+ T细胞耗竭对疗效的影响
摘要
受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）的支架功能赋予免疫检查点阻断（ICBs）的内在和外在耐药性，并成为改善癌症免疫治疗的有前景的靶点。为了应对RIPK1中间结构域内缺乏明确结合口袋所带来的挑战，我们利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术开发了一种RIPK1降解剂LD4172。LD4172在体外和体内均表现出有效且选择性的RIPK1降解。LD4172对RIPK1的降解可触发免疫原性细胞死亡、增强肿瘤浸润淋巴细胞反应，并使肿瘤对雌性C57BL/6J小鼠的抗PD1疗法敏感。这项工作报道了一种RIPK1降解剂，可作为研究RIPK1支架功能的化学探针，并作为增强肿瘤对ICBs疗法反应的潜在治疗剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过靶向RIPK1支架功能来克服肿瘤对免疫检查点阻断的耐药性？
- 核心机制
- LD4172通过泛素-蛋白酶体系统降解RIPK1，消除其支架功能，损害TNF-α诱导的NF-κB激活，从而在TNF-α存在时触发肿瘤细胞凋亡和免疫原性细胞死亡，增强抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- LD4172在体外诱导RIPK1降解（DC50=4–400 nM），在B16F10和MC38肿瘤模型中与抗PD1联合显著抑制肿瘤生长，并增加肿瘤浸润CD8+ T细胞、减少调节性T细胞；CD8+ T细胞耗竭消除了联合治疗的疗效。
- 研究意义
- 该工作提供了一种RIPK1降解剂作为化学探针，并证明了药理学降解RIPK1与抗PD1协同克服ICB耐药的潜力，为改善癌症免疫治疗提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LD4172体外降解活性与机制验证
验证LD4172对RIPK1的降解效力、特异性及依赖性机制。
在不同细胞系中测定DC50/Dmax；通过NanoBRET和TR-FRET评估靶点结合；使用MLN4924和Carfilzomib抑制UPS通路验证降解机制；蛋白质组学分析降解特异性。
LD4172对TNF-α诱导凋亡的影响
评估LD4172降解RIPK1对TNF-α介导的细胞凋亡和免疫原性细胞死亡的影响。
B16F10细胞联合TNF-α和LD4172处理，检测NF-κB活性、凋亡标志物（膜联蛋白V/PI）、cleaved caspase-3/7、PARP、细胞外ATP、HMGB1和钙网蛋白。
体内药代动力学和药效学研究
评估LD4172在体内的代谢稳定性和组织分布，确定最佳给药方案。
对C57BL/6J小鼠进行静脉或腹腔给药，测定血浆药物浓度和组织中RIPK1降解水平，评估hERG抑制风险。
体内药效评价与免疫微环境分析
验证LD4172单药或联合抗PD1对肿瘤生长的抑制作用及其免疫机制。
建立B16F10和MC38荷瘤模型，给予LD4172和/或抗PD1治疗，测量肿瘤体积、生存期，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞、免疫组化检测凋亡和免疫标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | MT10013CV | |
| 胎牛血清 | GE Healthcare | SH30071.03 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140163 | |
| Western blot | RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3493 |
| Cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Cleaved caspase-7抗体 | Cell Signaling Technology | 8438 | |
| Cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| HMGB1抗体 | Cell Signaling Technology | 3935 | |
| 钙网蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 12238 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| ECL底物 | Kindle Biosciences | R1100 | |
| 成像仪 | Kindle Biosciences | D1001 | |
| NF-κB报告基因 | 含NF-κB响应元件的NanoLuc报告载体 | Promega | N1111 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 凋亡检测 | FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 556547 |
| RealTime-Glo细胞外ATP检测试剂盒 | Promega | GA5010 | |
| TR-FRET | GST-RIPK1蛋白 | SignalChem | R07-11G-10 |
| 铽标记抗GST抗体 | Cisbio | 61GSTTLF | |
| 蛋白质组学 | EasyPep MS样品制备试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A45733 |
| 串联质谱标签试剂 | Thermo Fisher Scientific | 90113 | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354262 |
| 抗PD1抗体 | BioXcell | BE0146 | |
| 抗CD8抗体 | BioXcell | BE0004 | |
| 聚乙二醇400 | -- | -- | |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Liberase消化酶 | Roche | 05401020001 |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| 红细胞裂解液 | Biolegend | 420301 | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 156603 | |
| DAPI | BioLegend | -- | |
| ELISA | HMGB1 ELISA试剂盒 | NOVUS | NBP2-62767 |
| 免疫组化/免疫荧光 | SignalStain增强免疫组化检测试剂 | Cell Signaling Technology | 8114 |
| SignalStain DAB底物 | Cell Signaling Technology | 8059 | |
| 免疫荧光 | CD8抗体 | eBioscience | 14-0808-82 |
| CD4抗体 | Novus Biologicals | NBP1-19371 | |
| FOXP3抗体 | Novus Biologicals | NB100-39002 | |
| F4/80抗体 | Novus Biologicals | NB600-404 | |
| ProLong Diamond防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| CRISPR基因编辑 | Neon转染系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LD4172体外降解实验 | 细胞系（Jurkat, B16F10等），LD4172浓度（0.1–10 µM），处理时间（24小时），检测方法（Western blot） 阅读提示：Methods: Western blotting; Figure 2B |
| 凋亡实验 | B16F10细胞，TNF-α浓度（100 ng/mL），LD4172浓度（1 µM），T2I浓度（1 µM），Z-VAD-FMK浓度（25 µM），处理时间（72小时） 阅读提示：Figure 3; Methods: Apoptosis detection |
| 动物实验 | 小鼠品系（雌性C57BL/6J，6周龄），肿瘤细胞接种数（3×10^5），治疗剂量（LD4172 20 mg/kg i.p. 每日；抗PD1 100 μg i.p. 每3天），治疗起始肿瘤体积（约100 mm³） 阅读提示：Methods: Animal treatment and tumor challenges |
| 流式分析TIL | 肿瘤消化酶（Liberase 2 mg/mL，DNase I 50 μg/mL），消化时间（30分钟），染色抗体面板（CD45, CD3, CD4, CD8, PD1, IFN-γ等） 阅读提示：Methods: Analysis of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) by flow cytometry |