设计并验证APRIL和BAFF开关
构建四种开关（Myc-APRIL、APRIL-Myc、Myc-BAFF、BAFF-Myc），评估其结合能力和免疫突触形成能力。
将Myc标签融合到APRIL或BAFF的N端或C端，纯化后通过ELISA、SEC、流式结合实验、免疫荧光共聚焦显微镜和细胞毒性实验评估其功能。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
拆分设计增强基于配体的CAR-T细胞对多种B细胞恶性肿瘤的治疗效果
Split-design approach enhances the therapeutic efficacy of ligand-based CAR-T cells against multiple B-cell malignancies.
实验完整度
高包含体外免疫突触形成、细胞毒性、细胞因子释放实验，体内多种异种移植瘤模型，以及患者原代样本验证，具有功能与机制验证。
主要模型
RPMI8226细胞系（多发性骨髓瘤模型） Nalm6细胞系（B-ALL模型） Raji细胞系（非霍奇金淋巴瘤模型） 患者原代肿瘤细胞
重点核对
Myc标签融合位点（N端或C端）对开关功能的影响 CAR铰链长度（CD8、CD28、IgG4m）优化 开关剂量（0.3-3mg/kg）和CAR-T细胞剂量（1×10^6-30×10^6） 靶细胞抗原表达密度（BAFFR、BCMA、TACI） 肿瘤模型接种方式和时间
摘要
为了解决免疫逃逸问题，多特异性CAR-T细胞策略利用天然配体特异性结合恶性细胞上的多种受体。在此背景下，我们提出了一种拆分CAR设计，包含T细胞上表达的通用受体和基于配体的开关分子，该设计保留了配体如APRIL和BAFF的天然三聚体结构。在优化铰链和开关标记位点后，拆分设计的CAR-T细胞确保了配体的天然构象，促进了靶癌细胞与CAR-T细胞之间最佳免疫突触的形成。我们的CAR-T细胞策略在雌性小鼠的各种B细胞恶性肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性，可能在传统CAR-T细胞疗法后抗原丢失或转换的情况下防止免疫逃逸。这种基于配体的拆分CAR设计为优化CAR识别、增强疗效并可能提高临床转化的安全性提供了思路，并可能广泛适用于基于天然受体或配体的细胞疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过拆分设计保留天然配体APRIL和BAFF的构象，以增强CAR-T细胞对多种B细胞恶性肿瘤的疗效并克服抗原逃逸？
- 核心机制
- 拆分设计将配体与CAR分离，通过Myc标签连接到配体N端，并使用IgG4m短铰链，保留了配体天然三聚体结构，促进了靶细胞与CAR-T细胞之间的免疫突触形成，增强了T细胞激活和抗肿瘤活性。
- 主要证据
- 体外实验显示拆分设计的CAR-T细胞相比常规CAR-T细胞形成更强的免疫突触（PKC-θ荧光强度）和细胞毒性，并诱导更高水平的细胞因子分泌。在异种移植模型中，BAFF或APRIL拆分设计CAR-T细胞对多种B细胞恶性肿瘤（包括MM、B-ALL、NHL）显示出优异的肿瘤控制和生存期延长，尤其在抗原逃逸模型中优于CD19/CD22 CAR-T或CD19 CAR-T。
- 研究意义
- 该拆分设计策略提供了一种通用平台，通过更换开关分子可重定向CAR-T细胞靶向不同肿瘤，可能防止抗原逃逸并提高CAR-T细胞疗法的灵活性和安全性，具有临床转化潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化CAR铰链设计
测试不同铰链长度（CD8、CD28、IgG4m）对sCAR-T细胞活性影响，选择最佳铰链。
构建三种不同铰链的9E10 CAR-T细胞，通过免疫突触形成、细胞毒性和细胞因子分泌评估功能。
体外比较拆分设计CAR与常规配体CAR
评估拆分设计相比常规配体CAR-T细胞在保留配体天然功能方面的优势。
将APRIL和BAFF常规CAR-T细胞与拆分设计的sCAR-T细胞进行免疫突触形成、细胞毒性和细胞因子分泌的比较实验。
评估体内抗肿瘤疗效
在多种B细胞恶性肿瘤异种移植模型中评价拆分设计CAR-T细胞的抗肿瘤效果和安全性。
使用MM、B-ALL、NHL异种移植模型，包括抗原逃逸模型，输注CAR-T细胞和开关，监测肿瘤生长、生存期、细胞因子水平和CAR-T细胞持久性。
体内顺序重定向验证
验证使用不同开关可顺序靶向不同肿瘤。
在MM和B-ALL双肿瘤模型中，先用Myc-APRIL清除MM，随后用Myc-BAFF重定向CAR-T细胞控制B-ALL，监测肿瘤负荷、细胞因子和CAR-T细胞扩增。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建和表征开关蛋白
验证CAR-T细胞功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | HyClone | SH30255.01 |
| 胎牛血清 | Yoshi | A1015 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 蛋白质表达 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985-070 |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences, Inc. | 24765-1 | |
| 蛋白质纯化 | Ni螯合琼脂糖凝胶 | Solarbio | P2010 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝胶色谱柱 | GE Healthcare | 28989335 | |
| 蛋白质分析 | Superdex 200 Increase 10/300GL凝胶色谱柱 | Cytiva | 28990944 |
| AKTA pure蛋白质纯化系统 | GE HealthCare | -- | |
| 牛血清白蛋白 | ExCell Bio | C-BSA00100 | |
| 卵清蛋白 | Shanghai yuanye Bio-Technology | S12015 | |
| 核糖核酸酶A | Shanghai yuanye Bio-Technology | R21097 | |
| 抑肽酶 | Shanghai yuanye Bio-Technology | S10089 | |
| UNICORN 6.3软件 | -- | -- | |
| 分离PBMC | Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液 | Cytiva | 17144003 |
| 病毒包装 | 脂质体转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 |
| T细胞激活 | DynaBeads人T细胞激活磁珠CD3/CD28 | Gibco | 11141D |
| T细胞培养 | X-VIVO 15培养基 | LONZA | 04-418Q |
| 白细胞介素-2 | GenScript | Z00368-50 | |
| 白细胞介素-7 | GenScript | Z02704 | |
| 白细胞介素-15 | GenScript | Z03308 | |
| 流式细胞术 | APC标记抗人BAFFR抗体 | BioLegend | 316916 |
| PE标记抗人BCMA抗体 | BioLegend | 357504 | |
| PE标记抗人TACI抗体 | BioLegend | 311906 | |
| APC标记抗人CD3抗体 | BioLegend | 300312 | |
| Pacific Blue标记抗人CD3抗体 | BioLegend | 300329 | |
| FITC标记抗人CD45抗体 | BioLegend | 304038 | |
| PE标记抗人CD22抗体 | BioLegend | 302506 | |
| APC标记抗人CD19抗体 | BioLegend | 302212 | |
| Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG二抗 | Invitrogen | A21235 | |
| Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG F(ab')2片段 | Invitrogen | A21237 | |
| FITC标记山羊抗Myc标签多克隆抗体 | Abcam | ab1263 | |
| 7-AAD染色液 | BD BioSciences | 51-68981E | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | HRP标记山羊抗人IgG抗体 | BBI | D110150-0100 |
| Cytation 5细胞成像多功能酶标仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 免疫荧光 | 生物素标记抗人PKC-θ抗体 | Signalway Antibody | C33151 |
| PE标记链霉亲和素 | BioLegend | 405204 | |
| Hoechst染料 | Solarbio | C0031 | |
| 防荧光淬灭剂 | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| A1R激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞毒性实验 | CFSE细胞增殖示踪试剂盒 | BioLegend | 423801 |
| 细胞因子检测 | 人IL-2检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7025-88 |
| 人IFN-γ检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7316-88 | |
| 人TNF-α检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7346-88 | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂 | Mei5bio | MF182-plus-01 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318-M | |
| 抗人CD3ζ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1239 | |
| HRP标记抗小鼠IgG二抗 | TransGen Biotech | HS201-01 | |
| 抗人CD19抗体 | Boster | BM4935 | |
| 抗人CD22抗体 | Boster | BM4178 | |
| 体内实验 | IRDye800CW近红外荧光染料 | LI-COR | P/N |
| D-荧光素 | Energy Chemical | E011308 | |
| IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 开关蛋白设计 | Myc标签融合位点（N端或C端）及连接肽GGGGS 阅读提示：参见Methods中的'Structure designs of CARs and switch fusions' |
| CAR-T细胞构建 | CAR铰链类型（CD8、CD28、IgG4m）、单链抗体克隆9E10、细胞内信号域41BB-CD3ζ 阅读提示：参见Methods中的'Structure designs of CARs and switch fusions'及补充图5a |
| 体外功能实验 | E:T比、开关浓度、共培养时间（通常24小时） 阅读提示：参见Methods中的'In vitro cytotoxicity assay'和'Cytokine release assay' |
| 体内实验 | 小鼠品系（NSG或BALB/c）、肿瘤细胞系和接种量、CAR-T细胞剂量、开关剂量和给药频率、IL-7支持剂量 阅读提示：参见Methods中的'In vivo efficacy study'和'In vivo synergistic efficacy study' |
| 抗原逃逸模型 | CD19或CD22敲除Nalm6细胞系的构建、细胞混合物比例 阅读提示：参见Methods中的'Generation of CD19- or/and CD22-knockout cell lines' |