动物感染模型验证rnf144a在Lm感染中的作用
评估rnf144a缺陷对小鼠Lm感染存活率、器官细菌载量及先天免疫反应的影响
使用rnf144a敲除小鼠静脉感染Lm，监测生存率，检测肝脏和脾脏细菌载量及炎症因子表达
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RNF144A在单核细胞增生李斯特菌感染期间通过靶向BECN1降解抑制自噬
RNF144A inhibits autophagy by targeting BECN1 for degradation during L. monocytogenes infection.
实验完整度
高包含动物感染模型、细胞水平功能验证、机制研究（蛋白互作、泛素化、降解）以及体外泛素化实验，多层次证据支持。
主要模型
小鼠模型 BMDMs MEFs HeLa细胞
重点核对
Lm感染剂量、时间和MOI rnf144a基因敲除小鼠或细胞 BECN1及其突变体（K117R、K427R、2KR） 自噬抑制剂（Baf A1、CQ、NH4Cl） MG132蛋白酶体抑制剂处理
摘要
单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，Lm）在实验室中广泛用作研究革兰氏阳性胞内细菌的发病机制和宿主防御的感染模型。巨自噬（以下简称“自噬”）在宿主防御细菌、病毒和寄生虫等病原体中起重要作用。BECN1在自噬启动中发挥关键作用，越来越多的证据表明BECN1的翻译后修饰为自噬调控提供了多种策略。在本研究中，我们证明了RBR家族成员RNF144A（环指蛋白144A）在Lm感染时被诱导，以自噬依赖性但STING1非依赖性的方式促进Lm感染。小鼠中rnf144a缺陷保护小鼠免受Lm感染，并抑制先天免疫反应。有趣的是，RNF144A减少了Lm诱导的自噬体积累。机制研究表明，RNF144A与BECN1相互作用并促进其K48连接的泛素化，导致随后BECN1的蛋白酶体依赖性降解和自噬体积累减少。进一步研究表明，RNF144A促进了BECN1在K117和K427位点的泛素化，这两个泛素化位点对于BECN1在自噬和Lm感染中的作用至关重要。因此，我们的发现提示了细胞内细菌感染和自噬中的一个新调节因子，这可能有助于我们理解宿主通过自噬防御细胞内细菌感染的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNF144A在单核细胞增生李斯特菌感染中如何调控宿主防御，其机制是否涉及自噬和BECN1？
- 核心机制
- RNF144A与BECN1相互作用，促进其K48连接的泛素化，导致BECN1蛋白酶体依赖性降解，从而抑制自噬体形成，促进Lm感染。该过程依赖RNF144A的RING结构域，且不依赖STING1。
- 主要证据
- 在BMDMs、MEFs和HeLa细胞中，rnf144a缺失或敲低增加Lm诱导的LC3-II积累，减少细菌载量；RNF144A过表达则相反。机制实验显示RNF144A直接与BECN1结合，促进其泛素化和降解，并通过BECN1 K117/K427位点发挥作用。
- 研究意义
- 本研究揭示RNF144A是调节自噬和胞内细菌感染的重要因子，为理解宿主通过自噬防御胞内细菌感染的机制提供了新见解，可能为自噬相关疾病的治疗开发提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞水平验证rnf144a对Lm感染的影响
验证rnf144a缺失或敲低对细胞Lm感染和免疫反应的影响
从rnf144a敲除小鼠分离BMDMs、PMs和MEFs，或用siRNA敲低人THP1细胞中RNF144A，进行Lm感染，检测细菌载量及免疫因子
验证RNF144A对Lm诱导自噬的影响
确定RNF144A是否调控Lm诱导的自噬体积累
在rnf144a敲除MEFs/BMDMs或RNF144A过表达HeLa细胞中感染Lm，检测LC3-II水平，使用Baf A1区分合成与降解
验证RNF144A在基础及应激条件下对自噬的影响
评估RNF144A在基础状态和应激条件下对自噬的调控作用
在野生型和rnf144a敲除细胞中检测基础LC3-II水平，或使用雷帕霉素、EBSS刺激，同时使用Baf A1观察累积
验证RNF144A与BECN1的相互作用
确认RNF144A与BECN1是否发生物理相互作用
通过免疫共沉淀、共聚焦显微镜和PLA实验检测外源或内源性RNF144A-BECN1相互作用
验证RNF144A促进BECN1的K48泛素化
确定RNF144A作为E3连接酶促进BECN1的泛素化类型
在HEK293T细胞中共转染RNF144A和BECN1及泛素突变体，检测泛素化水平；体外泛素化实验验证直接E3活性
验证RNF144A促进BECN1的蛋白酶体降解
确认RNF144A促进BECN1降解依赖于泛素-蛋白酶体途径
过表达RNF144A后检测BECN1蛋白水平，使用CHX追踪降解速率，使用MG132或3-MA或NH4Cl抑制不同降解途径
验证RNF144A调控Lm感染依赖BECN1
确认RNF144A对自噬和Lm感染的影响依赖于BECN1
在BECN1敲低或使用Com19（BECN1-ATG14相互作用抑制剂）的情况下，检测RNF144A缺陷或过表达对LC3-II和细菌载量的影响
验证RNF144A的RING结构域功能
确定RNF144A促进BECN1泛素化和Lm感染需要功能性RING结构域
在rnf144a缺陷细胞中回补野生型或RING突变体（C20/23A、C198A），检测BECN1泛素化、降解和Lm感染
鉴定BECN1泛素化位点
确定RNF144A介导的BECN1泛素化的赖氨酸残基
构建BECN1赖氨酸点突变体，检测过表达RNF144A后的泛素化水平，筛选影响泛素化的位点，并用2KR突变体进行功能验证
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
动物模型构建与感染分析
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | BI | C3103-0500 |
| RPMI 1640培养基 | BI | C3001-0500 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 免疫印迹 | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗HA抗体 | Biolend | 901,515 | |
| 抗MYC抗体 | Proteintech | 66,004–1-Ig | |
| 抗RNF144A抗体 | Proteintech | 26,144–1-AP | |
| 抗RNF144A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc -393,432 | |
| 抗BECN1抗体 | Proteintech | 11,306–1-AP | |
| 抗LC3抗体 | MBL | PM036 | |
| 抗Lm抗体 | Abcam | ab35132 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| 抗K48连接泛素抗体 | Millipore | 05–1307 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483T | |
| 抗TBK1抗体 | Proteintech | 67,211–1-lg | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗IRF3抗体 | Proteintech | 11,312–1-AP | |
| 抗磷酸化STING1抗体 | Cell Signaling Technology | 85735 | |
| 抗STING1抗体 | Proteintech | 19,851–1-AP | |
| 抗磷酸化RELA/p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗RELA/p65抗体 | Proteintech | 10,745–1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 60,008–1 | |
| 细胞处理 | 佛波酯 | Beyotime Biotechnology | S1819 |
| STING1抑制剂C-176 | Selleck | S6575 | |
| 巴弗洛霉素A1 | Cayman Chemical | 11038 | |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| 3-甲基腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | M9281 | |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| MG132 | Millipore | 474790 | |
| Com19 | MCE | HY-156237 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018CN |
| 实时定量PCR | SYBR Green实时定量PCR预混液 | Vazyme | Q711–03 |
| 7500 Fast实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| ELISA | IFNB ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00187 |
| TNF ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7346-88 | |
| TNF ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7323-88 | |
| IL6 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7064-88 | |
| RNA干扰 | Silencer Select阴性对照siRNA | Invitrogen | 4390843 |
| 细菌培养 | 脑心浸液琼脂 | -- | -- |
| 细菌感染 | 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | 1045-41-0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8020 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon A1R显微镜 | Nikon | -- |
| 体外转录翻译 | TNT快速偶联转录/翻译系统试剂盒 | Promega | L1171 |
| 体外泛素化 | 泛素化试剂盒 | Enzo Life Science | BML-UW9920 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染模型 | 小鼠品系：C57BL/6J；rnf144a缺陷；感染剂量（1.5e5或4e3 CFU）；感染途径（静脉）；细菌载量测定器官（肝脏、脾脏）；动物伦理审批号 阅读提示：Materials and methods: Mice; Lm infection and enumeration of bacterial load |
| 细胞感染 | 细胞类型（BMDMs、PMs、MEFs、HeLa、THP1）；Lm感染MOI（2或10）；感染时间；胞外菌清除方法（庆大霉素100 μg/ml） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, transfection, and stimulation; Lm infection and enumeration of bacterial load |
| 自噬检测 | 自噬标志物LC3-II；Baf A1浓度（400 nM）；CQ浓度（100 μM）；NH4Cl浓度（5 mM）；处理时间 阅读提示：Results: RNF144A inhibits Lm-induced autophagosome accumulation; Figure legends 3 and 4 |
| 蛋白互作与泛素化 | RNF144A和BECN1表达质粒及突变体；泛素突变体（K48、K63等）；转染剂量；免疫共沉淀抗体 阅读提示：Materials and methods: cDNA constructs and reagents; Immunoprecipitation and immunoblot assays; Results: RNF144A interacts with BECN1 and promotes ubiquitination |
| 基因敲除或敲低 | rnf144a敲除小鼠；siRNA序列（A1、A2、A3）及转染试剂；敲除细胞系（THP1、HeLa）来源 阅读提示：Materials and methods: Mice; RNA interference; Cell culture |